1、由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的豬腹瀉給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，該病毒屬于套式病毒目、冠狀病毒科、甲型冠狀病毒屬，基因組為單股正鏈RNA，大小約28kb，共編碼16個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(nsp1～nsp16)，4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（S蛋白、E蛋白、M蛋白、N蛋白）及一個(gè)輔助蛋白ORF3。
　　在病毒的感染過(guò)程中，宿主細(xì)胞能夠產(chǎn)生多種抵抗病毒入侵的分子，包括干擾素（Inte

2、rferon，IFN），促炎性細(xì)胞因子以及趨化因子等。干擾素及其誘導(dǎo)的干擾素刺激基因(IFN-stimulated genes，ISGs)是宿主抗病毒感染的重要防御機(jī)制，但病毒往往進(jìn)化出各種策略拮抗宿主干擾素的抗病毒作用，從而達(dá)到感染宿主并致病的目的。已有研究證實(shí)PEDV具有抑制Ⅰ型IFN產(chǎn)生和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力，但對(duì)其編碼的nsp7蛋白在其中的作用尚不清楚。鑒于此，本論文以PEDV nsp7為研究對(duì)象，開(kāi)展了以下研究:
　　1.PE

3、DV nsp7抑制ISRE啟動(dòng)子活化和ISGs的產(chǎn)生
　　PEDV可以感染不同年齡段的豬，因此其免疫逃逸策略的研究十分值得我們關(guān)注。而許多病毒拮抗IFN的免疫應(yīng)答多是憑借其編碼產(chǎn)生的蛋白實(shí)現(xiàn)的。因此，本研究篩選了參與抑制ISRE啟動(dòng)子活化的PEDV編碼蛋白，結(jié)果顯示，nsp7能夠顯著抑制IFN-α介導(dǎo)的ISRE啟動(dòng)子活化，且其抑制效果呈明顯的劑量依賴性。同時(shí)，熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)PEDV nsp7能夠顯著抑制ISG15、ISG5

4、4及ISG56在mRNA水平上的表達(dá)。
　　2.PEDV nsp7不影響JAK1、Tyk2、STAT1和STAT2磷酸化和ISGF3的形成
　　許多病毒在進(jìn)化過(guò)程中形成多種策略來(lái)擾亂Ⅰ型IFN的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Western blot實(shí)驗(yàn)顯示，PEDV nsp7不影響JAK1、Tyk2、STAT1和STAT2的蛋白表達(dá)以及磷酸化水平，同時(shí)對(duì)STAT1/STAT2/IRF9三者組成的復(fù)合物ISGF3的形成也沒(méi)有影響，但是可以顯著抑制

5、ISGF3復(fù)合物誘導(dǎo)的ISRE啟動(dòng)子活化，并且與ISGF3間存在相互作用。ISGF3的入核是ISGs產(chǎn)生的必須環(huán)節(jié)。PEDV nsp7不影響STAT1、STAT2的表達(dá)與磷酸化及ISGF3復(fù)合物的形成，但卻抑制ISGF3誘導(dǎo)的ISRE啟動(dòng)子活性，那么它是否會(huì)影響STAT1、STAT2的入核呢？我們分別進(jìn)行間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)和胞質(zhì)胞核分離實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，PEDV nsp7能夠顯著抑制STAT1、STAT2、IRF9的核轉(zhuǎn)運(yùn)。

6、　　3.PEDV nsp7與KPNA1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合STAT1，阻礙ISGF3核轉(zhuǎn)運(yùn)
　　由于PEDV nsp7明顯地抑制STAT1、STAT2、IRF9的入核，且PEDV nsp7與ISGF3復(fù)合物存在相互作用，推測(cè)PEDV nsp7的抑制效果可能是通過(guò)與STAT1、STAT2或IRF9相互作用實(shí)現(xiàn)的。通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)我們得出結(jié)論，PEDV nsp7與IRF9間不存在相互作用，但可與STAT1、STAT2發(fā)生互作，且特異性結(jié)合ST

7、AT2的DBD結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域在STATs蛋白家族中同源性較高，存在非典型的NLS序列，是ISGF3復(fù)合物被核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白KPNA1識(shí)別的關(guān)鍵氨基酸序列。鑒于此，我們利用CO-IP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)nsp7是否影響KPNA1與STAT1的結(jié)合。結(jié)果表明，隨著nsp7轉(zhuǎn)染量的增加，KPNA1與STAT1間的互作逐步減弱，因此，PEDV nsp7通過(guò)與KPNA1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合STAT1，抑制KPNA1對(duì)STAT1的識(shí)別，從而特異性阻礙了ISGF3核轉(zhuǎn)運(yùn)。

8、r>　　4.PEDV nsp7負(fù)調(diào)控Ⅰ型IFN信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與nsp8無(wú)關(guān)
　　已有研究表明，貓冠狀病毒nsp7/nsp8復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)2∶1的異源三聚體形式，與nsp7的結(jié)合可增強(qiáng)nsp8的RNA聚合酶活性;SARS冠狀病毒中nsp7/nsp8以8∶8的形式組成十六聚體，能夠顯著增強(qiáng)nsp8具有的RdRp活性且具有引物延伸能力。那么，nsp7對(duì)JAK-STAT信號(hào)通路的抑制作用是否與nsp8相關(guān)呢？我們將nsp7、nsp8單獨(dú)轉(zhuǎn)染