1、為了解天花粉蛋白(Trichosanthin,Tk)誘導(dǎo)免疫抑制的機(jī)制，并探索其作為一種免疫調(diào)節(jié)劑用于器官移植免疫排斥反應(yīng)特異性治療的可行性，本文從下述兩方面進(jìn)行了研究。 一、天花粉蛋白誘導(dǎo)CD4+CD25-T細(xì)胞向CD4+CD25+Foxp3+Treg分化 已有的研究顯示，低劑量天花粉蛋白(100ng/ml)通過(guò)下調(diào)樹(shù)突狀細(xì)胞(dendreticcells,DC)表面共刺激分子CD80和LFA-1的表達(dá)，阻止DC成熟誘

2、導(dǎo)免疫抑制。 DC是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞(APC)，也是唯一能激活初始型T細(xì)胞的APC，具有雙向調(diào)節(jié)作用，是移植免疫的中樞。不同分化狀態(tài)、不同亞型的DC具有不同的功能，成熟DCs(mDCs)能有效地激活初始型T細(xì)胞，并產(chǎn)生免疫記憶；非成熟DCs(iDCs)能誘導(dǎo)初始型T淋巴細(xì)胞免疫耐受。大量的研究證明，iDC誘導(dǎo)初始型T細(xì)胞向調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化，通過(guò)后者介導(dǎo)免疫耐受。 既然天花粉蛋白通過(guò)阻止DC成熟誘導(dǎo)免疫抑制

3、，那么其免疫抑制作用可能與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞密切相關(guān)。因此，我們推測(cè)：天花粉蛋白誘導(dǎo)CD4+CD25-T細(xì)胞向CD4+CD25+Foxp3+Treg分化，并通過(guò)后者介導(dǎo)免疫抑制。 為了驗(yàn)證推測(cè)，本部分做了以下研究： 實(shí)驗(yàn)方法：1、用免疫磁珠方法(MACS)分選小鼠CD4+CD25-T細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定純度。 2、在低劑量Tk(100ng/ml)存在的條件下，用Balb/c鼠滅活脾細(xì)胞刺激C57BL/6鼠CD4+CD2

4、5-T細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)4周，以滅活的C57BL/6脾細(xì)胞為APC，以不加Tk組為對(duì)照；用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定培養(yǎng)2、4周后CD4+CD25+T細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率。 3、用MACS方法分選上述培養(yǎng)系統(tǒng)中不同實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)4周的CD4+CD25+T細(xì)胞，RT-PCR測(cè)定Foxp3表達(dá)。 4、用anti-CD3刺激不同實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)4周的CD4+CD25+T細(xì)胞48小時(shí)，ELISA法測(cè)定培養(yǎng)上清液中IL-10和TGF-β的含量。 5、混合淋巴

5、細(xì)胞反應(yīng)技術(shù)測(cè)定不同實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)4周的CD4+CD25+T細(xì)胞的免疫抑制功能。 6、測(cè)定Tk誘導(dǎo)出的CD4+CD25+T細(xì)胞(Tk-Treg，C57BL/6MHC背景，Balb/cMHC抗原特異性)抑制T細(xì)胞增殖的抗原特異性(Balb/c滅活脾細(xì)胞為刺激細(xì)胞，昆明鼠滅活脾細(xì)胞為無(wú)關(guān)抗原對(duì)照，C57BL/6T細(xì)胞為反應(yīng)細(xì)胞)。 結(jié)果：1、MACS方法分選小鼠CD4+CD25-T細(xì)胞純度達(dá)99.2％； 2、誘導(dǎo)培養(yǎng)2周

6、時(shí)Tk誘導(dǎo)組和對(duì)照組CD4+CD25+T細(xì)胞分別占總細(xì)胞數(shù)的35％和11％，4周時(shí)分別占38％和37％； 3、Tk誘導(dǎo)組CD4+CD25+T細(xì)胞(Tk-Treg)Foxp3基因高表達(dá)，而對(duì)照組CD4+CD25+T細(xì)胞(A-CD4+CD25+T)不表達(dá)Foxp3； 4、Tk誘導(dǎo)組CD4+CD25+T細(xì)胞分泌大量IL-10和中等量的TGF-β，48小時(shí)培養(yǎng)上清液中TGF-β和IL-10含量分別為1386±157.3pg/ml

7、和1893±198.6pg/ml，而對(duì)照組含量極低分別為212±25.7pg/ml和252±28.2pg/ml，差異顯著(p＜0.01)； 5、當(dāng)CD4+CD25+T：CD4+CD25-T細(xì)胞比例為1∶1，1∶2，1∶4，1∶8時(shí)，Tk誘導(dǎo)組Tk-Treg對(duì)CD4+CD25-T細(xì)胞增殖抑制百分率分別為：80±3.7％、77±3.5％和75±3.8％、39.5±1.7％，抑制呈劑量依賴性。而對(duì)照組A-CD4+CD25+T細(xì)胞無(wú)抑制

8、功能； 6、當(dāng)CD4+CD25+T：CD4+CD25-T細(xì)胞比例為1∶1，1∶2，1∶4，1∶8時(shí)，Tk-Treg對(duì)Balb/c滅活脾細(xì)胞為抗原刺激的T細(xì)胞增殖抑制百分率分別為：(同上)；而對(duì)無(wú)關(guān)對(duì)照抗原刺激的T細(xì)胞增殖抑制百分率分別為：17.5±3.1％、11±2.8％、7±1.2和6±1.8％。差異顯著(p值均＜0.01)，表明，Tk-Treg抑制T細(xì)胞增殖具有抗原特異性。 結(jié)論：1、Tk誘導(dǎo)初始型CD4+CD25-

9、T細(xì)胞向CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化，通過(guò)后者介導(dǎo)免疫耐受。 2、Tk-Treg免疫抑制作用具有抗原特異性。 二、天花粉蛋白促進(jìn)CD4+CD25+Treg增殖和分化TGF-β是免疫抑制性細(xì)胞因子，既能誘導(dǎo)CD4+CD25-T細(xì)胞向CD4+CD25+Foxp3+Treg分化，又能促進(jìn)CD4+CD25+Treg增殖、分化。 已有的研究顯示，在免疫抑制作用機(jī)制和功能上，Tk與TGF-β存在許多相似之處。那么，探索

10、Tk在促進(jìn)CD4+CD25+Treg增殖和分化中的作用就有可靠的理論依據(jù)，將從另外一個(gè)層面深入揭示Tk誘導(dǎo)免疫抑制的機(jī)制，同時(shí)也為CD4+CD25+Treg體外大量擴(kuò)增和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本部分就Tk在促進(jìn)CD4+CD25+Treg增殖和分化中的作用進(jìn)行了研究。 實(shí)驗(yàn)方法：1、MACS方法分選新鮮分離的CD4+CD25+T細(xì)胞(F-Treg)； 2、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)技術(shù)擴(kuò)增F-Treg，分5組：A組：反應(yīng)體系中

11、含照射過(guò)的刺激方APC、反應(yīng)方APC，反應(yīng)方F-Treg、IL-2(100ng/ml)，擴(kuò)增得到N-Treg； B組：F-Treg含在IL-2(100ng/ml)、10％胎牛血清(FCS)的RMPl1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，體系中不含刺激方APC、反應(yīng)方APC； C組：在A組基礎(chǔ)上加不同濃度Tk，擴(kuò)增得到Tk-TregD組：在A組基礎(chǔ)上加TGF-β和不同濃度Tk，擴(kuò)增得到Tt-Treg；E組：在A組基礎(chǔ)上加TGF-β，不加T

12、k，擴(kuò)增得到T-Treg； 細(xì)胞在含10％胎牛血清(FCS)、2ME(50uM)的RMPI1640培養(yǎng)液中，5％C02環(huán)境下培養(yǎng)擴(kuò)增14天。 3、擴(kuò)增后細(xì)胞臺(tái)盼蘭染色計(jì)活細(xì)胞總數(shù)，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定純度，計(jì)算各組擴(kuò)增效率。 4、、RT-PCR測(cè)定各組CD4+CD25+T細(xì)胞FoxP3mRNA。 5、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)技術(shù)測(cè)定擴(kuò)增后各組CD4+CD25+T細(xì)胞對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的抑制率。 6、混合淋巴細(xì)胞反

13、應(yīng)技術(shù)測(cè)定擴(kuò)增后各組CD4+CD25+T細(xì)胞對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖抑制的抗原特異性。 結(jié)果：1、MACS方法分選小鼠F-Treg純度達(dá)到99.6％。 2、擴(kuò)增2周各組的擴(kuò)增效率A組：CD4+CD25+T細(xì)胞擴(kuò)增115±10倍； B組：基本無(wú)擴(kuò)增； C組：當(dāng)Tk終濃度為800、400、200、100、50、25ng/ml時(shí)，CD4+CD25+T擴(kuò)增效率分別為120±11、131±7、145±8、172±10、16

14、4±9,150±8倍，與A組(不含Tk)相比，擴(kuò)增效率顯著提高(除Tk終濃度為800ng/ml外，p值均＜0.05)，Tk濃度為100ng/ml時(shí)，擴(kuò)增效率最高。 D組：當(dāng)Tk終濃度為800、400、200、100、50、25ng/ml時(shí)(與TGF-β1ng/ml聯(lián)合應(yīng)用)，擴(kuò)增效率分別為140±12，155±14，168±18，195±20，180±16，165±10倍，與C組相比，擴(kuò)增效率顯著提高(p值均＜0.05)。

15、 E組：擴(kuò)增152±11倍。 3、各組擴(kuò)增后的CD4+CD25+T細(xì)胞表面均高表達(dá)Foxp3。 4、在相同的Treg：CD4+CD25-T比例(1∶1，1∶2，1∶4，1∶8)下，N-Treg、Tk-Treg、T-Treg對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的抑制率均高于F-Treg(新鮮分離的CD4+CD25+Tr)，p值均＜0.05。 5、N-Treg、Tk-Treg、T-Treg對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的抑制均具有抗原特異性。