1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSC)在其Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)激活狀態(tài)下，可以分化為兩種亞型MSC1和MSC2。MSC1型指骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的TLR4激活后其可以增高表達(dá)促進(jìn)T淋巴細(xì)胞功能的分子，而TLR3激活后的MSC即MSC2型可以產(chǎn)生抑制T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)的因子。BMMSC在不同TLRs激活下分別具有促進(jìn)或者抑制T淋巴細(xì)胞免疫功能

2、的能力逐漸引起關(guān)注，并且TLRs激活后是否會(huì)影響B(tài)MMSC對(duì)B淋巴細(xì)胞功能相關(guān)的研究比較少。本課題主要研究了人和小鼠骨髓間充質(zhì)于細(xì)胞的不同種類的TLRs激活后對(duì)其產(chǎn)生的B淋巴細(xì)胞活化分子(B cell-activatingfactorbelonging to the TNF family，BAFF)的影響。研究發(fā)現(xiàn)人和小鼠的BMMSC的TLR4激活可以增高BAFF的表達(dá)，而TLR2和TLR3則對(duì)BAFF的表達(dá)沒有影響，且該現(xiàn)象與MSC1

3、和MSC2亞型分別具有的對(duì)免疫系統(tǒng)不同的作用相一致。并且NF-κB，p38 MAPK和JNK三條通路均參與了BAFF的產(chǎn)生。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特定的TLRs激活后可以產(chǎn)生促進(jìn)B淋巴細(xì)胞功能的因子，可以進(jìn)一步研究BMMSC的促免疫功能及特定亞群，以便可以更好地應(yīng)用于治療免疫相關(guān)的疾病中。
　　第一部分 人和小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)、特性鑒定
　　目的：分離、培養(yǎng)人和小鼠BMMSC，并鑒定其多向分化能力以及免疫表型
　

4、　方法：分別用密度梯度離心法和貼壁細(xì)胞篩選法分離人和小鼠原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，取P3-P5代細(xì)胞。用成脂肪培養(yǎng)基持續(xù)誘導(dǎo)14天，倒置顯微鏡觀察拍照，并用油紅O染色檢測(cè)其脂滴的形成。用成骨細(xì)胞培養(yǎng)基誘導(dǎo)21天后倒置顯微鏡觀察拍照，并用堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)檢測(cè)其誘導(dǎo)結(jié)果。用流式細(xì)胞術(shù)鑒定其表面分子標(biāo)志。
　　結(jié)果與結(jié)論：人和小鼠BMMSC在培養(yǎng)第14天左右細(xì)胞達(dá)90％融合，呈長(zhǎng)梭形渦樣生長(zhǎng)。人

5、和小鼠BMMSC誘導(dǎo)第14天油紅O染色顯示胞漿內(nèi)的脂滴被染成亮紅色。人和小鼠BMMSC成骨誘導(dǎo)第21天后可檢測(cè)到胞質(zhì)中含較多紫藍(lán)色堿性粒酸酶顆粒。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)P3代小鼠BMMSC細(xì)胞表面標(biāo)志分子，結(jié)果顯示小鼠BMMSC弱陽性表達(dá)CD106，強(qiáng)陽性表達(dá)Sca-1(stem cell antigen-1)、CD44，并且不表達(dá)血細(xì)胞的標(biāo)志CD34、CD45、CD31。同樣的方法檢測(cè)P3代人BMMSC細(xì)胞表面標(biāo)志，結(jié)果顯示人BMMSC均高表

6、達(dá)CD90、CD44、CD105，而不表達(dá)血細(xì)胞的標(biāo)志CD34、CD45、CD31。
　　第二部分 TLR2和TLR4對(duì)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多向分化能力影響的比較
　　目的：研究TLR2和TLR4對(duì)小鼠BMMSC的多向分化能力的影響。
　　方法：用zymosan作為TLR2的激動(dòng)劑，LPS作為TLR4的激動(dòng)劑。分別誘導(dǎo)小鼠BMMSC成脂肪和成骨分化，每?jī)商鞊Q液一次，換液同時(shí)分別加上述TLRs激動(dòng)劑（1μg/ml）。并分

7、別于誘導(dǎo)后14天、21天檢測(cè)其成脂，成骨分化效果。
　　結(jié)果與結(jié)論：誘導(dǎo)同時(shí)加TLRs激動(dòng)劑的實(shí)驗(yàn)組在誘導(dǎo)第14天用油紅O染色檢測(cè)，胞漿內(nèi)的脂滴被染成亮紅色。誘導(dǎo)同時(shí)加TLRs激動(dòng)劑的BMMSC在成骨誘導(dǎo)第21天可檢測(cè)到胞質(zhì)中含較多紫色堿性磷酸酶陽性顆粒。TLR2和TLR4激活均不影響小鼠BMMSC的成脂和成骨分化能力。
　　第三部分 TLR2，TLR3，TLR4對(duì)人和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞B細(xì)胞激活因子(BAFF)表達(dá)的影響及其

8、作用機(jī)制探討
　　目的：研究TLR2，TLR3，和TLR4激活對(duì)人和小鼠BMMSC B細(xì)胞激活因子(BAFF)的產(chǎn)生的影響及其作用機(jī)制。
　　方法：先用0，0.1μg/ml，0.5μg/ml，lμg/ml，5μg/ml，l0μg/ml濃度的LPS作用于小鼠BMMSC48小時(shí)。用zymosan，LPS（1μg/ml）分別刺激小鼠BMMSC48小時(shí)。用zymosan，Poly(I∶C)，LPS（1μg/ml）分別刺激人BMMSC

9、48小時(shí)。用封閉實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證TLRs受體的作用，分別使用TLR2，和TLR4的封閉抗體anti-TLR2和anti-TLR4以2μg/ml的濃度37C分別作用30分鐘，接著分別用TLR2和TLR4的激動(dòng)劑分別刺激48小時(shí)后檢測(cè)BAFF的表達(dá)。用三種TLR4通路的抑制劑PDTC（Pyrrolidinedithiocarbamic acid， NF-κB通路抑制劑），SP600125（JNK通路抑制劑），SB203580（p38 MAPK通路抑

10、制劑），以1μM的濃度37℃分別作用30分鐘，接著用LPS作用(1μg/ml)刺激48小時(shí)，用real time PCR和western blot檢測(cè)上述幾組細(xì)胞的BAFF的表達(dá)。用免疫熒光法觀察NF-κB通路激活后該蛋白的核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。
　　結(jié)果與結(jié)論：BAFF的表達(dá)并不完全是劑量依賴性增高，當(dāng)LPS的作用濃度為1μg/ml時(shí)小鼠BMMSC的BAFF表達(dá)最高。小鼠BMMSC的TLR4激活后，BAFF表達(dá)上升2-3倍(p＜0.05)

11、，而TLR2激動(dòng)劑作用后，BAFF表達(dá)只有少量上升(p＞0.05)。人BMMSC的TLR4激活后，BAFF表達(dá)上升2-3倍(p＜0.05)，而TLR3和TLR2激動(dòng)劑作用后只有微量上升，且沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TLR4封閉后BAFF下降了53.2±12.2％(p＜0.05)。NF-κB，JNK通路和p38 MAPK通路抑制后BAFF表達(dá)比TLR4激活分別下降了90.4±2.4％，87.0±7.2％ and97.9±4.8％。
　　綜上所

12、述，本研究(1)鑒定了分離的人和小鼠原代BMMSC的特性。(2)選用zymosan和LPS分別作為TLR2和TLR4的激動(dòng)劑，二者均不影響小鼠BMMSC的成骨，成脂分化能力。(3)小鼠和人BMMSC的TLR4通路激活后，其BAFF的表達(dá)增高了2-3倍。而TLR2和TLR3激活后沒有影響B(tài)AFF的表達(dá)。(4)JNK通路，NF-κB通路和p38 MAPK三條通路均參與了BAFF的產(chǎn)生過程。(5)TLR4通路激活后，NF-κB通路有核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象