1、目的： 本研究旨在探索BNP治療心力衰竭的新途徑。通過構(gòu)建重組腺病毒Ad-hBNP，制備CHF大鼠模型，觀察外源基因hBNP導入動物機體后在動物體內(nèi)的分布及表達，探討B(tài)NP對CHF治療作用及其機制，為今后BNP基因治療的臨床應用提供基礎(chǔ)研究的理論依據(jù)。 方法： 1.構(gòu)建重組腺病毒Ad-hBNP RT-PCR方法從人心肌組織獲得hBNP片段，與pUCm-T載體連接構(gòu)成pUC-hBNP重組質(zhì)粒；KpnⅠ、SalⅠ分別

2、雙酶切pUC-hBNP和pAdTrack-CMV，將目的片段插入pAdTrack-CMV構(gòu)建pAdTrack-hBNP重組質(zhì)粒；pAdTrack-hBNP重組質(zhì)粒經(jīng)PmeⅠ酶切線性化后，電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)入含有腺病毒骨架質(zhì)粒的E.coilBJ5183感受態(tài)細胞中，同源重組獲得重組質(zhì)粒pAdEasy-hBNP；經(jīng)BamHⅠ、PacⅠ酶切鑒定及基因序列檢測后，重組成功的pAdEasy-hBNP經(jīng)陽離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293T細胞，經(jīng)過包裝、擴增和純化后，

3、獲得可用于實驗性基因治療的重組腺病毒Ad-hBNP。 2.制備CHF大鼠模型采用腹主動脈縮窄法制備CHF大鼠模型。于右腎動脈分支處上方縮窄腹主動脈至0.6mm，同時設立假手術(shù)組及正常對照組。12周后行超聲心動圖及血液動力學檢測心臟結(jié)構(gòu)和功能、放射免疫分析測定血清AgⅡ和Ald水平、HE染色及Masson染色檢測心肌病理學變化、RT-PCR分析心肌膠原mRNA表達，綜合評價CHF大鼠心功能。確定動物實驗CHF大鼠入選標準。

4、 3.研究重組腺病毒Ad-hBNP對CHF大鼠的治療作用 （1）觀察CHF大鼠接受Ad-hBNP治療后，hBNP在體內(nèi)的分布與表達CHF大鼠24只，18只單次腹腔注射重組腺病毒Ad-hBNP后，隨機均分為1天組、4天組和7天組；另6只CHF大鼠不予以重組腺病毒，記為0點組。各實驗組動物于相應的時間處死，ELISA檢測血清hBNP水平，免疫組化檢測CHF大鼠各臟器hBNP的表達，RT-PCR檢測各組織hBNP mRNA的表達。

5、 （2）觀察Ad-hBNP對CHF大鼠的治療效果30只CHF大鼠，隨機分為Ad-hBNP組、Ad-Track組、NS組，另設假手術(shù)組不予任何治療作為對照組，分別經(jīng)腹腔注射予以相應治療，每周一次，共4周。4周后實驗動物行超聲心動圖及血液動力學檢測，ELISA檢測血清hBNP水平，放射免疫分析測定血清AgⅡ、Ald、ET及TNF-α含量，RT-PCR分析心肌膠原mRNA表達水平。 結(jié)果： 1.應用Ad-Easy缺陷性腺病

6、毒載體系統(tǒng)成功構(gòu)建重組腺病毒Ad-hBNP，純化后Ad-hBNP病毒滴度達到4.4275×1012VP/ml。透射電鏡觀察Ad-hBNP呈多面體結(jié)構(gòu)，顆粒直徑在90nm左右。 2.腹主動脈縮窄術(shù)12周后，經(jīng)超聲心動圖和血液動力學檢測、神經(jīng)內(nèi)分泌指標、病理學及RT-PCR測定心肌膠原mRNA表達等多種途徑，并結(jié)合臨床表現(xiàn)綜合評價，證實CHF動物模型造模成功。確定在體動物實驗CHF大鼠的入選標準：（1）大鼠腹主動脈結(jié)扎術(shù)后12周，出

7、現(xiàn)進食量減少，精神萎靡，少活動，被毛無光澤、蓬松。（2）超聲心動圖檢測指標：LVESD>0.32cm、VLEDD>0.65cm，EF<75%，F(xiàn)S<40%。 3.單次腹腔注射Ad-hBNP，CHF大鼠心臟、肝臟、肺臟、腎臟、脾臟及小腸均檢測到hBNP表達，外源性hBNP在CHF大鼠體內(nèi)的表達至少可持續(xù)7天。 4.間斷重組腺病毒Ad-hBNP治療，CHF大鼠IVS、LVEDD、LVESD、LVPW顯著降低，而EF、FS顯著

8、增高；同時CHF大鼠心功能明顯改善，表現(xiàn)為HR顯著降低，LVSP和+dP/dtmax顯著升高及LVEDP降低和-dP/dtmax絕對值升高。 5.與Ad-Track組及NS組比較，Ad-hBNP組血清AgⅡ、Ald、ET及TNF-α水平較明顯下降；心肌組織Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達顯著降低。 結(jié)論： 1.應用Ad-Easy缺陷性腺病毒載體系統(tǒng)可成功構(gòu)建重組腺病毒Ad-hBNP。 2.利用腹主動脈縮窄術(shù)可成功

9、制備CHF大鼠模型。 3.單次腹腔注射Ad-hBNP，外源hBNP基因可在CHF大鼠多臟器中得到有效表達，其生物學效應時間顯著長于BNP的生物半衰期。 4.間斷給予Ad-hBNP能夠有效地改善CHF大鼠心臟結(jié)構(gòu)、功能及心室重構(gòu)。BNP可能在抑制循環(huán)或局部神經(jīng)內(nèi)分泌-細胞因子水平發(fā)揮作用，對抗心室重構(gòu)。 應用BNP治療CHF是否有益目前尚存爭議，本研究就此問題得出了初步結(jié)果，認為BNP基因治療心力衰竭是一種新的嘗試