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1、腫瘤抗原MAGE-A1(Melanoma Antigen,Family A,1)在多種腫瘤中都有表達(dá),而在除睪丸之外的正常組織中不表達(dá).因此,這種腫瘤特異性表達(dá)就使得MAGE-A1成為一個(gè)可以運(yùn)用于腫瘤基因治療的候選基因.在肝細(xì)胞肝癌中,MAGE-A1常過量表達(dá),并在啟動(dòng)子區(qū)域呈低甲基化狀態(tài);為了解DNA甲基化介導(dǎo)的基因沉默機(jī)制,我們從如下幾方面分析了細(xì)胞中基因啟動(dòng)子的功能:(1)應(yīng)用半定量RT-PCR檢測(cè)該基因在肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平
2、;(2)應(yīng)用甲基化特異性PCR(Methylation Specific PCR,MSP)檢測(cè)該基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島在肝癌細(xì)胞株中的甲基化狀態(tài);(3)應(yīng)用甲基化特異性PCR檢測(cè)CpG島中各個(gè)位點(diǎn)在BEL-7402和HepG2中的甲基化狀態(tài);(4)應(yīng)用體外甲基化配合定點(diǎn)突變的方法,通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染與熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè),確定5個(gè)特殊CpG位點(diǎn)的關(guān)鍵性;(5)通過5'-缺失突變與連接掃描突變的方法,通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染與熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè),進(jìn)一步分析
3、了與該基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)的啟動(dòng)子的關(guān)鍵序列;(6)應(yīng)用電泳遷移率改變實(shí)驗(yàn)(Electrophoresis Mobility Shift Assay,EMSA)尋找與-30位CpG位點(diǎn)附近序列結(jié)合的核蛋白.在對(duì)MAGE-A1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究中,我們發(fā)現(xiàn):1.在所檢測(cè)的4株肝癌細(xì)胞株中,MAGE-A1啟動(dòng)子的去甲基化狀態(tài)與該基因在細(xì)胞中的表達(dá)相關(guān),且該基因的轉(zhuǎn)錄受到DNA甲基化的調(diào)控;2.MAGE-A1啟動(dòng)子的-81和-30位CpG位
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