1、第一章 Cx43分子在人正常視網(wǎng)膜及視網(wǎng)膜母細胞瘤(RB)組織中的表達。 目的：探討細胞間隙連接蛋白(Cx)43在人類正常視網(wǎng)膜組織及視網(wǎng)膜母細胞瘤(RB)組織中的表達規(guī)律及其在RB腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中的意義，為RB臨床診斷、治療及預后探索有效的分子指標。 方法：應用免疫組織化學方法檢測5例人正常視網(wǎng)膜組織和22例人RB組織中Cx43蛋白的表達及定位，并分別比較正常視網(wǎng)膜組織、RB組織及其瘤旁組織、未分化型與分化型RB組織

2、、局限期及蔓延擴展期腫瘤組織中Cx43蛋白表達的差異。 結(jié)果： 1．在人類視網(wǎng)膜組織神經(jīng)纖維層、神經(jīng)節(jié)細胞層、內(nèi)核層、視錐視桿細胞層、外界膜及色素上皮層中均有Cx43蛋白表達：在神經(jīng)纖維層、視錐視桿細胞層、外界膜及色素上皮層中呈全層性表達，而在神經(jīng)節(jié)細胞層及內(nèi)核層則呈散在點、簇狀表達。內(nèi)界膜、內(nèi)、外叢狀層及外核層未見明顯表達。 2．免疫組織化學染色評分：①RB組織中Cx43蛋白染色評分低于正常視網(wǎng)膜組織，二者相比

3、差異有顯著性意義(P<0.01)；②蔓延擴展期(Ⅳ～Ⅴ級)組織染色評分顯著低于局限期(Ⅰ～Ⅲ級)組織(P<0.05)，而每期內(nèi)各級組間相比均無顯著性差異(P>0.05)；③分化型RB組織中，Cx43蛋白染色評分高于未分化型組織，二者相比有顯著性差異(P<0.05)；④在正常視網(wǎng)膜組織、瘤旁組織及RB腫瘤組織中染色評分依次降低，兩兩相比統(tǒng)計學上有顯著性差異(P<0.05)。 結(jié)論： 1．人正常視網(wǎng)膜組織中存在Cx43蛋白的

4、固有、廣泛表達。 2．人RB組織中Cx43蛋白表達顯著降低，其表達水平與腫瘤的蔓延浸潤及分化程度呈負相關，而與腫瘤的體積大小無關。 3．Cx413蛋白表達異?？赡苁荝B腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的重要環(huán)節(jié)和促發(fā)因素，檢測其表達可能將作為評估腫瘤預后的有意義指標。 第二章全反式維甲酸對體外培養(yǎng)的RB細胞生長的影響。 目的：研究全反式維甲酸(ATRA)對體外培養(yǎng)的RB細胞生物學行為的影響，探索RB腫瘤藥物治療的新方法。

5、 方法：將體外培養(yǎng)的RB細胞隨機分為5組：A組：空白對照組；B組：實驗對照組(0.1％乙醇溶劑組)；C組：10<'-5> mol/L ATRA作用組；D組：10<'-6> mol/L ATRA作用組；E組：10<'-7> mol//L ATRA作用組。加入藥物進行干預后，分別于48h、96h和144h收集各組細胞。應用MTT比色法檢測細胞存活率；流式細胞術檢測細胞周期的變化及細胞凋亡的發(fā)生情況。 結(jié)果： 1．AT

6、RA誘導RB細胞增殖減少：與對照組A、B相比，經(jīng)ATRA作用后，各實驗組(C、D、E組)RB細胞均表現(xiàn)生長速度下降，存活率降低，其存活率變化與藥物濃度和作用時間呈負相關關系。 2．ATRA誘導RB細胞生長周期和凋亡發(fā)生改變：與對照組相比，三實驗組G<,0>/G<,1>期細胞比例逐漸增加而G<,2>M、S期細胞比例相應減少，同時，細胞凋亡率也逐漸升高。G<,0>/G<,1>期比例和凋亡率的增加與藥物濃度和作用時間呈正向變化關系。

7、 結(jié)論： 1．ATRA可抑制體外培養(yǎng)RB細胞的生長增殖。 2．ATRA通過阻滯RB細胞生長周期于G<,0>/G<,1>期并促進其凋亡而抑制細胞生長。在一定范圍內(nèi)，增加藥物濃度或延長作用時間可增強此藥物效應。 第三章全反式維甲酸對RB細胞Cx43基因及其蛋白表達的誘導作用。 目的：研究ATRA對體外培養(yǎng)的RB細胞Cx413基因及其蛋白表達的影響，探討ATRA抑制RB細胞生長的作用機制。 方法：

8、同前進行實驗分組和藥物干預，分別于藥物作用后48h、96h和144h收集各組細胞。應用Western blot印跡法檢測Cx43蛋白的表達變化；RT-PCR方法檢測Cx43mRNA的表達及改變。 結(jié)果： 1．經(jīng)ATRA作用后RB細胞Cx43蛋白表達增高：與對照組相比，各實驗組Cx413蛋白電泳條帶的光密度比率(ODR)值均增加。藥物作用48h后C組、作用96h后D組以及作用144h后E組其ODR值與A組相比統(tǒng)計學上均有顯

9、著性差異(P<0.05)。相關性分析結(jié)果顯示，ODR值的變化與藥物濃度和作用時間呈正相關關系。 2．經(jīng)ATRA作用后RB細胞的Cx43 mRNA表達增加：與對照組相比，各實驗組Cx43 mRNA電泳條帶ODR值均逐漸升高。ATRA作用48h后C組以及作用96h后D、E兩組ODR值與A組相比增高在統(tǒng)計學上均有顯著性差異(P<0.05)。相關性分析結(jié)果顯示，ODR值的增加與藥物濃度和作用時間呈正相關關系。 3．ATRA誘導R

10、B細胞中Cx43mRNA及其蛋白表達增高與其抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡在時間上具有同步性。 結(jié)論： 1．通過誘導RB細胞Cx43基因表達上調(diào)從而抑制細胞增殖并促進其凋亡是ATRA的重要藥理機制之一，在一定范圍內(nèi)，增加藥物濃度或延長藥物作用時間可增強此效應。 2．ATRA調(diào)控Cx43基因表達的作用位點可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。 3．Cx43基因及其蛋白分子是RB腫瘤治療的有效靶點。 第四章裸鼠眼內(nèi)RB模型

11、的建立及全反式維甲酸對在體腫瘤的抑制作用。 目的：通過動物模型檢驗ATRA對裸鼠RB腫瘤生長的影響，為藥物的臨床應用提供基礎性實驗依據(jù)。 方法：裸鼠眼前房接種體外培養(yǎng)的HXO-RB44細胞建立動物RB模型。將成瘤裸鼠隨機分為3組：A：空白對照組，即非治療組；B：實驗對照組，即假治療組(用0.5％無水乙醇的生理鹽水行前房注射)；C：治療組，用1μg ATRA行眼前房注射。給藥頻率：每3d注射一次，共治療3周。每天觀察動物眼

12、前房腫瘤形成情況及眼前節(jié)局部反應。觀察結(jié)束時，摘取眼球制作石蠟切片，應用HE染色方法檢測眼內(nèi)腫瘤的生長情況及病理學特征。 結(jié)果: 1．前房接種體外培養(yǎng)的HXO-RB414細胞成功建立了BALB/C裸鼠眼部RB腫瘤動物模型，成瘤率為73.3％。 2．動物于接種后6～9d開始成瘤。A組腫瘤生長快，于接種20d后幾乎占據(jù)整個前房；觀察期末(接種后25～30d)，術眼眼球脹大，角膜水腫并新生血管形成。C組腫瘤生長較A組緩

13、慢，接種后20d該組最大腫瘤體積約占前房1/3；觀察期末，最大腫瘤體積<3/4前房。該組腫瘤控制率為50％。B組腫瘤體積變化與A組相比無明顯差別，腫瘤控制率0％。 3．組織切片病理學檢查：A、B組瘤體細胞生長較緊密，前房、晶體后及玻璃體腔均可見瘤細胞生長；C組腫瘤組織相對疏松，瘤細胞分布基本局限于前房，少量見于虹膜后方，但晶體后及玻璃體腔未見瘤細胞侵犯。移植瘤組織學特點與人RB腫瘤組織相似，細胞形態(tài)光鏡下觀察三組間未見明顯差別。