1、 目的：最近研究表明法舒地爾在哮喘中起著重要的作用,但目前機(jī)制仍不十分清楚,因此本實(shí)驗(yàn)研究Rho激酶(Rho-kinase, ROCK)-1抑制劑法舒地爾在支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)中抗炎和抗氧化應(yīng)激的作用,探討ROCK-1抑制劑在哮喘中的作用。方法：本實(shí)驗(yàn)分三部分：1. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：5~6周健康BALB/C雌性小鼠24只,隨機(jī)分為對(duì)照組、哮喘組和法舒地爾組,每組 8 只。哮喘組和法舒地爾組用卵清蛋白(Ovalbumin, OVA)溶液腹腔

2、注射與鼻腔滴入致敏和激發(fā),法舒地爾組在滴鼻前用法舒地爾干預(yù),對(duì)照組給予同等劑量生理鹽水。激發(fā)后各組均測(cè)定氣道反應(yīng)性,行肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid, BALF)細(xì)胞計(jì)數(shù),肺組織蘇木精—伊紅(Hematoxylin-eosin staining, HE)染色和高碘酸—希夫(Periodic Acid-Schiff, PAS)染色,免疫印記(Western Blot)法檢測(cè)NF-κB、PNF-κB、S

3、TAT6、PSTAT6、TNF-α和Rho激酶-1,免疫熒光測(cè)定MUC5AC的表達(dá)水平,ROS熒光探針-DHE檢測(cè)肺組織內(nèi)活性氧族物質(zhì)(Reactive Oxygen Species, ROS)的表達(dá)情況。2. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：分為對(duì)照組、屋塵螨組和法舒地爾組,法舒地爾組先予法舒地爾(濃度為45umol/l)干預(yù)1h 后,屋塵螨組和法舒地爾組同時(shí)予屋塵螨(濃度為20ug/ml)干預(yù)24h后,用Western Blot法檢測(cè)NF-κB、PNF-

4、κB、STAT6、PSTAT6、TNF-α和Rho激酶-1,免疫熒光測(cè)定MUC5AC及ROS熒光探針-DHE檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)情況。3. 臨床實(shí)驗(yàn)：收集哮喘發(fā)作期患者16例,隨機(jī)分為常規(guī)治療組和常規(guī)+法舒地爾(靜脈輸入,30mg/天)治療組,每組 8例,每組治療療程為1周,收集治療前后血清標(biāo)本各一份,采用ELISA法檢測(cè)血清中IL-3、IL-4、IL-17和TNF-α的濃度。結(jié)果：1. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：(1)氣道的增強(qiáng)呼氣間歇(Enhan

5、cedpause, Penh)值變化：法舒地爾組與哮喘組相比Penh值降低,氣道反應(yīng)性降低(P<0.05)。(2) BALF中細(xì)胞學(xué)變化：法舒地爾組與哮喘組相比白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞比例和嗜酸性粒細(xì)胞(Eosinophils, EOS)的比例降低(P<0.05)。(3)各組小鼠肺組織鏡下病理改變：哮喘組見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)于支氣管及周圍肺組織,其中以中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞最多,支氣管及肺泡腔內(nèi)有滲出物,部分氣管黏膜上皮壞死脫落,伴杯狀細(xì)胞及

6、平滑肌細(xì)胞增生。法舒地爾組與哮喘組相比氣道炎癥明顯減輕,MUC5AC熒光強(qiáng)度減弱(P<0.05),氣道內(nèi)黏液分泌減少(P<0.05)。(4) 法舒地爾組與哮喘組相比,肺組織內(nèi)ROS的表達(dá)濃度降低(P<0.05)。(5) 法舒地爾組與哮喘組相比NF-κB、PNF-κB、STAT6、PSTAT6、TNF-α和Rho激酶-1表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。2. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：(1)法舒地爾組與屋塵螨組相比,肺組織內(nèi)ROS的表達(dá)量降低(P<0.0

7、5)。(2)法舒地爾組與屋塵螨組相比MUC5AC熒光值明顯減弱(P<0.05)。(3)法舒地爾組與屋塵螨組相比NF-κB、PNF-κB、STAT6、PSTAT6、TNF-α 和 Rho 激酶-1 表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。3. 臨床實(shí)驗(yàn)：常規(guī)治療組和常規(guī)+法舒地爾治療組在治療前后血清IL-3、IL-4、IL-17和TNF-α水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),治療后較治療前下降,但常規(guī)+法舒地爾治療組前后治療的血清IL-3、

8、IL-4、IL-17和TNF-α濃度差值明顯高于比常規(guī)哮喘組,并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：1. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：哮喘小鼠通過上調(diào)哮喘相關(guān)因子和蛋白表達(dá)而誘發(fā)小鼠氣道高反應(yīng)性、肺組織的炎癥和氧化應(yīng)激,從而引發(fā)一系列哮喘臨床癥狀。給予法舒地爾提前干預(yù)能在一定程度上減輕這一作用。2. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：屋塵螨可誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞( 16 human bronchial epithelial cells, 16HBE)的氧化應(yīng)激,上調(diào)相關(guān)炎癥因子