1、目的：通過菌落表型變化并結(jié)合生物膜生長缺陷篩選并鑒定可能與結(jié)核分枝桿菌生物膜形成相關(guān)基因。
　　方法：利用帶有Himar1轉(zhuǎn)座子的MycoMarT7轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)建立結(jié)核分枝桿菌H37Ra隨機(jī)插入突變庫;篩選細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)發(fā)生變化和生物膜形成有變化的突變菌株;運用T-A克隆法并結(jié)合抗性標(biāo)記挽救法獲得突變菌株的隨機(jī)插入基因側(cè)翼序列,使用通用引物M13F和M13R進(jìn)行測序,將測序結(jié)果與結(jié)核分枝桿菌H37Ra全基因組序列進(jìn)行比對,并分析判斷從

2、而鑒定轉(zhuǎn)座子插入位點。并運用生物信息學(xué)方法分析預(yù)測突變基因的功能,進(jìn)而鑒定出與菌落形態(tài)或者生物膜形成相關(guān)基因。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建庫容量約為1×104結(jié)核分枝桿菌轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入突變文庫。通過菌落形態(tài)變化及生物膜缺陷表型篩選出39株突變株,成功鑒定出插入位點的突變菌株有16株,涉及16個基因發(fā)生突變,與野生株相比,其中8株成膜能力未發(fā)生任何變化,在20~25d即可形成生物膜,而編號P7C8的突變株為生物膜完全缺陷株,細(xì)菌培養(yǎng)觀察至7

3、周時間,依然未見生物膜形成表型;其余7株均出現(xiàn)生物膜生長或成熟延遲情況,其中2株成膜時間為30d時在氣液界面才出現(xiàn)薄膜樣,5株在40d左右才開始在氣液表面形成肉眼可見的薄膜層。運用生物信息學(xué)方法預(yù)測,16個發(fā)生突變的基因中5個與脂質(zhì)代謝相關(guān),4個與細(xì)胞壁合成相關(guān)、2個與中間代謝和呼吸作用相關(guān)、1個調(diào)節(jié)蛋白相關(guān)基因,1個毒力相關(guān)基因,1個PE/PPE家族基因,還有2個功能未知基因。結(jié)合生物膜形成缺陷分析,其中8個基因可能與H37Ra體外生