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文檔簡介
1、產氣腸桿菌屬于腸桿菌科之腸桿菌屬,是院內獲得性感染的重要病原菌之一,可引起肺炎、心內膜炎、皮膚軟組織感染、腹腔感染、關節(jié)炎、骨髓炎、尿路感染和菌血癥等。近年來產氣腸桿菌引起的醫(yī)院感染逐年增加,由于不少感染菌株同時產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)和頭孢菌素酶(AmpC),因而對大多數(shù)β-內酰胺類抗菌藥物存在耐藥性,僅對碳青霉烯類抗菌藥物仍維持較高的敏感性。碳青霉烯類抗菌藥物對極大多數(shù)由質?;蛉旧w介導的β-內酰胺酶都有較高的穩(wěn)定性,與青
2、霉素結合蛋白(PBPs)親和力強,導致細菌細胞的延長和溶解,能有效滲透細菌外膜進入周質間隙,并且存在抗菌藥物后效應,是目前所使用的抗菌藥物中抗菌譜最廣,抗菌活性最強,具有快速殺菌作用的一類抗菌藥物。隨著碳青霉烯類抗菌藥物臨床應用的增加,亞胺培南耐藥的產氣腸桿菌陸續(xù)被分離,給臨床治療造成困難,引起廣泛重視。 腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的機制主要有三種: 一、碳青霉烯酶的產生; 二、藥物作用靶位的改變;
3、 三、外膜蛋白(outer member protein)的缺失或數(shù)量的減少伴有質?;蛉旧w介導高水平β-內酰胺酶的持續(xù)產生。 碳青霉烯酶分為A類、B類和D類,目前僅A類碳青霉烯酶KPC-2和B類碳青霉烯酶IMP-1-like,IMP-1,VIM-2在產氣腸桿菌中有報道;碳青霉烯類抗菌藥物能與革蘭陰性菌的PBP1和PBP2結合,如PBP發(fā)生改變抗菌藥物不能結合或親和力下降,則產生耐藥,目前全世界僅發(fā)現(xiàn)1株產氣腸桿菌由于PBP
4、2a的改變造成亞胺培南耐藥;對革蘭陰性菌而言,外膜通透性對藥物進出菌體至關重要。膜上有親水性的藥物通道蛋白稱外膜蛋白,主要有兩種,分子量較大的為OmpF,分子量較小的為OmpC,外膜蛋白的缺失或數(shù)量的減少均可以導致細菌耐藥性的發(fā)生。產氣腸桿菌對亞胺培南的耐藥主要由于Omp36的減少或缺失伴有ESBLs和或AmpC的產生引起。Omp36屬于OmpC類蛋白家族,為跨膜通道蛋白,暴露于細胞表面,占據(jù)著膜孔。已有報道,Omp36的表達水平的調節(jié)
5、與OmpX的調節(jié)級聯(lián)密切相關,從而使決定孔蛋白通道直徑的保守環(huán)Loop 3的電勢平衡發(fā)生改變,進而造成亞胺培南不能進入細胞內。為明確我國亞胺培南耐藥的產氣腸桿菌的耐藥機制,本研究分析了臨床分離到的產氣腸桿菌的克隆相關性、耐藥性、耐藥基因、耐藥傳播機制,為亞胺培南耐藥的產氣腸桿菌感染的防治提供基礎。深入了解產氣腸桿菌的耐藥機制和耐藥性的傳遞特性,對于指導臨床合理使用抗菌藥物和防止耐藥株的流行有著重要的意義。 1.亞胺培南耐藥的產氣
6、腸桿菌耐藥性研究收集2005年1月~3月我院一位肝移植術后患者分離到的4株產氣腸桿菌,C1、C3分離自腹水,C2、C4分離自血液,其中C3、C4是在患者使用亞胺培南和美羅培南治療40天后分離到。脈沖凝膠電泳(PFGE)結果表明,4株試驗菌株酶切條帶完全一致,均來自同一克隆株。4株產氣腸桿菌對頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢哌酮、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢吡肟、慶大霉素、阿米卡星及青霉素復合制劑哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/克拉維酸均耐藥;對多粘菌素
7、B、多粘菌素E和替加環(huán)素均敏感;C1、C2對亞胺培南、美羅培南敏感,而C3、C4對亞胺培南耐藥、美羅培南中介。接合菌株對亞胺培南、美羅培南、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢他啶敏感:對除頭孢他啶外的三代頭孢菌素和含β-內酰胺酶抑制劑的復合制劑、阿米卡星、慶大霉素均耐藥,對替卡西林/克拉維酸的耐藥性降低。PCR證實4株產氣腸桿菌TEM-1、CTX-M-3、CTX-M-14、SHV-12和DHA-1基因陽性,未檢測到碳青霉烯酶基因。TEM-1、CT
8、X-M-3和DHA-1 β-內酰胺酶可通過肉湯接合進行轉移。Western blot顯示C1、C2表達OmpE36蛋白,而C3、C4不表達OmpE36蛋白。PCR擴增C3、C4的ompE36基因發(fā)現(xiàn),在結構基因的97 bp后,IS903-like插入其中,引起ompE36基因的移碼框改變,從而使OmpE36蛋白缺失。通過基因敲除菌株C1中的ompE36基因可導致亞胺培南、美羅培南的MIC值升高32倍,說明OmpE36在亞胺培南耐藥中起著
9、重要的作用。 2.ompE36基因在大腸桿菌中的克隆和表達根據(jù)已發(fā)表的產氣腸桿菌omp36基因序列(GenBank登錄號AF335467)設計引物,對C1進行PCR擴增,獲得了長度為1110 bp片段,經測序及BlastN比對發(fā)現(xiàn)與omp36基因高度同源(核苷酸同源性為95%,氨基酸同源性為89%)新的孔蛋白編碼基因ompE36(GenBank登錄號EF191076)。將其克隆到原核表達載體pQE30,與組氨酸(His)標簽融合
10、表達。經異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導后△OmpE36融合蛋白在大腸桿菌中以包涵體形式表達,表達量達到22.3%。經Western blot檢測也表明,表達的融合蛋白能與His單抗特異地反應。 3.△OmpE36蛋白的純化及兔抗OmpE36多克隆抗體的制備在大腸桿菌中表達的△OmpE36蛋白主要以包涵體形式存在,經過尿素變性,用鎳瓊脂凝膠柱將其純化,通過Millipore中分子量蛋白超濾管濃縮OmpE36蛋白,得到
11、了純度為93%、濃度為3.3 mg/mL的重組蛋白。并以該濃縮液與弗氏完全佐劑混合乳化后免疫家兔,制備了兔抗OmpE36多克隆抗體,經瓊脂糖擴散試驗測定其效價為1∶32。提純的OmpE36蛋白及制備的多抗為下一步用間接酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測抗體的效價提供基礎。 4.間接ELISA法檢測兔抗OmpE36多克隆抗體效價用表達的純化的重組OmpE36蛋白抗原包被ELISA板,利用制備的兔抗OmpE36多克隆抗體與該抗原結合,并對最
12、適包被濃度、血清稀釋度、最適封閉液、最佳顯色時間進行了試驗。獲得的OmpE36抗體的效價為1∶400。 以上研究表明: 1.我院臨床分離的產氣腸桿菌對亞胺培南耐藥是由于產多種β-內酰胺酶(TEM-1、SHV-12、CTX-M-3、CTX-M-14和DHA-1)并伴有OmpE36孔蛋白的缺失所致。 2.脈沖凝膠電泳分析,4株產氣腸桿菌來自同一克隆株,提示在使用碳青霉烯類抗菌藥物治療感染的同時,也增加了細菌對其耐藥的
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