1、鴨病毒性腸炎(Duck Virus Enteritis,DVE)又名鴨瘟(Duck Plague,DP)，是由鴨腸炎病毒(Duck Enteritis Virus,DEV)引起的鴨、鵝等禽類的一種急性、接觸性傳染病，其特征是血管損傷、組織出血、消化道黏膜糜爛、淋巴器官病變、實(shí)質(zhì)性器官退行性病變，各種年齡的禽均可發(fā)病。鴨腸炎病毒(Duck EnteritisVirus,DEV)又名鴨瘟病毒(Duck Plague Virus,DPV)，系

2、α皰疹病毒亞科成員之一，但屬的劃分尚無定論。本研究通過提取DEV基因組，對(duì)不同的DEV毒株進(jìn)行限制性酶切分析；通過構(gòu)建含有EGFP完整閱讀框的真核轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒對(duì)DEV基因組中的復(fù)制非必需區(qū)進(jìn)行了初步篩選，為進(jìn)一步研究DEV奠定一定的實(shí)踐基礎(chǔ)。 1.將DEV疫苗株和分離株在雞胚成纖維細(xì)胞上增殖。分離株經(jīng)兩次傳代即可適應(yīng)雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，且病毒滴度隨培養(yǎng)代次的增加而不斷提高。 2.采用兩種不同的方法提取鴨腸炎病毒基因組

3、核酸。第一種方法先采用差速離心的方法純化病毒粒子，再用苯酚/氯仿抽提即得到病毒核酸。第二種方法首先用高滲液使細(xì)胞完全破碎，然后加入微球菌核酸酶將細(xì)胞DNA完全消化，再加入蛋白酶K將細(xì)胞蛋白以及病毒的蛋白衣殼消化，最后用苯酚/氯仿抽提即得到病毒基因組核酸。限制性內(nèi)切酶EcoRV消化，結(jié)果表明第二種方法得到的DNA純度較高，無細(xì)胞DNA污染。用PCR方法對(duì)提取的樣品進(jìn)行鑒定，證明獲得的DNA樣品確為DEV基因組。用8種限制性內(nèi)切酶對(duì)DEV疫

4、苗株和分離株的基因組進(jìn)行酶切比較分析，酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果表明，Xbo Ⅰ和EcoRV產(chǎn)生的酶切圖譜兩者幾乎完全一致，Mlu Ⅰ、HindⅢ、和Kpn Ⅰ僅有個(gè)別條帶不同，而EcoR Ⅰ、BglⅡ和ApaL Ⅰ產(chǎn)生的條帶數(shù)目和條帶遷移率差別比較明顯。 3.用PCR方法擴(kuò)增獲得鴨腸炎病毒TK基因并將其克隆入pMD18-T載體，將完整的EGFP閱讀框插入TK內(nèi)部的EcoRV位點(diǎn)，構(gòu)建出轉(zhuǎn)移載體pTK-EGFP。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出US2

5、全基因，并將其克隆入pGM-T載體。用BamH Ⅰ和EcoRV雙酶切重組載體，使LIS2基因內(nèi)部缺失約130bp片段，將完整的EGFP閱讀框插入BamH Ⅰ和EcoRV酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建了轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體pUS2-EGFP。用一個(gè)1.9 kb DEV基因組BamH Ⅰ酶切片段構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體，該片段含有病毒基因組US1-US10片段大部分基因。用Mlu Ⅰ和Nru Ⅰ兩種限制酶雙酶切，使US1 ORF3’末端至US10 ORF 5’末端之間58

6、3 bp片段缺失，將EGFP閱讀框連入Mlu Ⅰ和Nru Ⅰ位點(diǎn)之間，構(gòu)建出轉(zhuǎn)移載體pUS1-EGFP-US10。 4.利用Lipofectamine2000將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染己感染DEV的CEF，通過優(yōu)化細(xì)胞數(shù)量和轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的數(shù)量，確定了最佳轉(zhuǎn)染條件。經(jīng)過傳代和純化，重組質(zhì)粒能夠通過與。DEV在CEF中發(fā)生同源重組得到穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的重組病毒，重組病毒能夠在CEF上傳3～4代，并形成綠色的熒光斑，說明TK、15S2、US1和US10為