1、骨髓間充質干細胞（Bone mesenchymal stem cell，BMSCs）具有極強的自我復制和多向分化潛能，來源廣泛，易于獲取并且具有低免疫源性，可將BMSCs用于細胞移植治療，具有非常重要的理論研究意義和臨床價值。近年來的研究提示，骨髓間充質干細胞能轉分化為肝細胞，這一現(xiàn)象為臨床上應用BMSCs移植治療肝損傷和急慢性肝功能衰竭展示了一個可喜的前景?，F(xiàn)已證實，在體外培養(yǎng)條件下BMSCs可由肝細胞生長因子（hepatocyte

2、growth factor，HGF）等細胞因子誘導向肝細胞分化，并可釋放多種肝細胞因子，但對BMSCs體內移植后能否向具肝細胞功能的細胞分化并對受損肝臟起修復作用的研究則鮮見報道。因此，本課題將大鼠骨髓中分離獲得的BMSCs在體外純化、擴增后通過門靜脈移植入肝損傷大鼠體內，觀察BMSCs移植后在肝臟內的分布及受損肝臟修復情況，為臨床應用提供理論依據(jù)。 第一部分大鼠骨髓間充質干細胞的分離、培養(yǎng)與簽定。 目的:建立大鼠骨髓間

3、充質干細胞分離和培養(yǎng)擴增的方法，同時對其生物學特性進行研究，為BMSCs作為種子細胞治療臨床疾病提供理論依據(jù)。 方法:聯(lián)合應用密度梯度離心法和貼壁細胞培養(yǎng)法進行分離獲取大鼠BMSCs，應用流式細胞儀測定細胞表面標記物來鑒定所培養(yǎng)的細胞是否為BMSCs；在倒置顯微鏡下觀察BMSCs的形態(tài)學特點，細胞計數(shù)測定BMSCs接種貼壁率，并繪制出生長曲線。 結果:通過聯(lián)合密度梯度離心法與貼壁細胞培養(yǎng)方法分離培養(yǎng)出的BMSCs純度高。

4、BMSCs體外培養(yǎng)生長旺盛，具有活躍的增殖能力。培養(yǎng)的BMSCs陽性表達CD29、CD44，陰性表達CD34、CD45。 結論:通過聯(lián)合密度梯度離心與貼壁細胞培養(yǎng)方法能從骨髓中獲得骨髓間充質干細胞；獲得的BMSCs在體外生長穩(wěn)定，且增殖較快，可作為組織工程的種子細胞。 第二部分慢病毒轉染大鼠骨髓間充質干細胞研究。 目的:對分離、培養(yǎng)到第三代的大鼠骨髓間充質干細胞進行慢病毒載體介導的基因轉染，觀察其轉染效率及對骨髓間

5、充質干細胞生物活性的影響，為骨髓間充質干細胞基因治療研究提供實驗基礎。 方法:利用密度梯度離心、貼壁篩選法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質干細胞。利用脂質體法進行慢病毒感染大鼠BMSCs。 結果:體外分離培養(yǎng)的骨髓間充質干細胞，經攜帶綠色熒光蛋白（green fluorescence protein，GFP）的慢病毒轉染72h后可見綠色熒光蛋白的表達，96h后達到高峰。轉染后的骨髓間充質干細胞體外繼續(xù)培養(yǎng)，1月后仍可見綠色熒光蛋白

6、的表達，但表達強度較前減弱。在一定病毒復數(shù)范圍內，慢病毒對骨髓間充質干細胞的轉染率隨病毒復數(shù)的增加而增高，當病毒復數(shù)為5時，轉染率達到80%以上；但病毒復數(shù)超出一定范圍后，轉染率反而下降。慢病毒轉染后的骨髓間充質干細胞生長曲線和未轉染的骨髓間充質干細胞生長曲線未見明顯變化。 結論:慢病毒對大鼠BMSCs有較高的轉染率，且攜帶的GFP能在BMSCs內有效表達，可以作為骨髓間充質干細胞基因治療的載體和體內示蹤。 第三部分骨髓

7、間充質干細胞移植對肝功能影響的實驗研究。 目的:觀察同種異體骨髓間充質干細胞移植在肝臟特定微環(huán)境下是否向具肝細胞功能的細胞分化并探討其對大鼠受損肝臟修復作用的可行性。 方法:利用密度梯度離心、貼壁篩選法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質干細胞。經慢病毒轉染后的第3代BMSCs從門靜脈植入肝大部分切除大鼠體內，分別于移植后7、14、28d行血清肝功能檢測，分析BMSCs對肝功能的作用。移植后的第28d取出肝臟，通過冰凍切片熒光檢測，觀

8、察BMSCs在大鼠肝臟內定居分布情況。 結果:大鼠連續(xù)用2-乙酰氨基芴（2-acetylaminofluorene，2-AAF）灌喂6d后出現(xiàn)精神萎靡、厭食、少活動、尿深黃；肉眼見肝臟明顯充血腫大、邊緣圓鈍、表面可見針尖樣細小顆粒、呈局灶性，偶見有小出血點；HE見部分肝細胞腫脹、胞質疏松。術后BMSCs移植組和DMEM/F12注射組各肝功能檢測指標均隨著時間的延長逐漸恢復；BMSCs移植組與DMEM/F12注射組比較，ALB、A

9、LT和AST均有顯著性差異（P<0.05）。術后28d，BMSCs移植組與正常組比較，ALB、ALT、AST、ALP均無顯著性差異（P>0.05）； DMEM/F12注射與正常組比較，ALB、ALT均有顯著性差異（P<0.05）。這些表明BMSCs移植對肝功能的恢復有促進作用。術后冰凍切片，BMSCs移植組可見BMSCs定居于肝臟內，主要在匯管區(qū)周圍，肝實質里也可見散在分布，而心、肺、脾、腎未見BMSCs。HE染色BMSCs移植組肝小葉