1、人體的整體功能上的協(xié)調(diào)統(tǒng)一是通過細胞與細胞間的相互識別、聯(lián)絡(luò)和相互作用而實現(xiàn)的，這種存在于細胞內(nèi)和細胞間的識別、聯(lián)絡(luò)和相互作用，又在多個層次上具有交叉調(diào)控，形成了一個十分復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。我們把細胞接受外界信號，通過一整套特定的機制，將胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)為胞內(nèi)信號，最終調(diào)節(jié)特定基因表達，并引起細胞的應(yīng)答反應(yīng)稱為細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。細胞的種種功能活動受到復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控，精細調(diào)節(jié)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是正常生命活動的前提，而信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常可以導(dǎo)致病理過程

2、。 許多研究表明，如果控制細胞增殖、分化的信息傳遞通路中某一環(huán)節(jié)異常，就會引起細胞生長失控，可以導(dǎo)致腫瘤形成或者腫瘤凋亡。在介導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的眾多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，以PI3-K/Akt/PTEN/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對凋亡的調(diào)節(jié)作用尤其重要。PI3-K/Akt/PTEN/mTOR信號傳導(dǎo)通路活化可以抑制多種刺激誘發(fā)的細胞凋亡，促進細胞周期進展，從而促進細胞的生存和增殖，同時參與血管形成，在腫瘤的形成中扮演重要角色，并參與腫瘤的侵襲

3、和轉(zhuǎn)移。而且該信號傳導(dǎo)通路還通過誘導(dǎo)腫瘤細胞生存、分化和血管形成，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展和耐藥方面發(fā)揮重要作用，也因此成為腫瘤干預(yù)治療的新靶點。 膽管癌主要指源于肝外膽管的惡性腫瘤，預(yù)后不佳。流行病學(xué)少見，國外尸檢發(fā)現(xiàn)率為0.01％～0.5％，占惡性腫瘤總數(shù)的3％，我國尸檢占0.07％～0.3％，其檢出率逐年增高。而臨床上對膽管癌的治療頗為棘手。進一步探討PI3-K/Akt/PKB通路的調(diào)節(jié)以及與其他通路的交聯(lián)，提高對該通路在膽管

4、癌中的作用的認識，有助于更好地理解其惡性行為，并針對該信號傳導(dǎo)通路尋找新的抗腫瘤藥物，對于膽管癌的治療將具有十分重要的意義。 在鄒聲泉教授的領(lǐng)導(dǎo)下，我們課題組在前期的研究中通過對膽管癌腫瘤生物學(xué)特性的研究有了深入的研究，認識到膽管癌中有癌基因k-ras、c-erbB-2和c-myc,抑癌基因PTEN、p53、DPC4/Smad、p15和p16以及凋亡相關(guān)基因bcl-2和bax的突變、缺失或過表達，在肝外膽管癌的分子細胞遺傳學(xué)研究

5、取得了很大的進展，而我們也從前期研究的與膽管癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因出發(fā)，結(jié)合與腫瘤的形成、凋亡和轉(zhuǎn)移，并在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展和耐藥方面發(fā)揮重要作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路PI3K/AKT/PTEN/mTOR出發(fā)，對該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在膽管癌的凋亡及對化療增敏作用做出一些探討和研究。為肝外膽管癌的診斷和治療探討新的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。但由于時間的關(guān)系，我們的實驗尚局限于較淺的層面，在今后的工作中我們將作進一步深入研究。 第一部分：肝外膽管

6、癌mTOR、Akt和PTEN蛋白表達 論文1.肝外膽管癌mTOR、Akt和PTEN的表達及生物學(xué)意義 目的 研究PI3K/PTEN/AKT/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中mTOR、Akt和PTEN蛋白在膽管癌中的表達，及其在膽管癌發(fā)生，發(fā)展中的作用。 結(jié)論 1.PTEN較正常對照的膽管組織的高表達是降低的，而mTOR和Akt的表達是升高的； 2.PTEN和Akt、mTOR的關(guān)系密切，并呈負性相關(guān)，

7、說明了PTEN的失活性，Akt和mTOR的低表達在膽管癌的生長增殖中是有一定作用的，并且有密切的關(guān)系。 第二部分：PTEN-PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系 論文2.體外轉(zhuǎn)染PTEN抑制膽管癌QBC939細胞生長及下調(diào)mTOR表達的研究 目的 研究信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路PI3K/AKT/PTEN/mTOR中抑癌基因PTEN體外對膽管癌QBC939細胞生長的抑制作用，及對下游mTOR表達的影響

8、。 結(jié)論 1.將攜帶有綠色熒光蛋白GFP的野生型PTEN導(dǎo)入QBC939細胞中，發(fā)現(xiàn)細胞的PTEN蛋白的表達增強，磷酸化AKT的表達明顯降低；而轉(zhuǎn)染不具有磷酸酶活性的突變型PTEN的QBC939細胞雖然PTEN的表達也增強，但AKT的表達無明顯改變。說明PTEN對腫瘤細胞的調(diào)控與脂質(zhì)酶的磷酸化有密切關(guān)系。 2.轉(zhuǎn)染前后腫瘤細胞的凋亡率有顯著意義的改變也提示PTEN可使細胞停滯于G1期。 3.轉(zhuǎn)染前后mTO

9、R相應(yīng)的改變說明，PI3K/AKT/PTEN與mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系密切。 4.PTEN作為一種重要的抑癌基因?qū)δ懝馨┘毎w外作用有重要影響，其主要的機制可能是通過PI3K/AKT/PTEN信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，作用于蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯有重要調(diào)控作用的關(guān)鍵產(chǎn)物mTOR，對其產(chǎn)生直接影響。 論文3.pcDNA3.1-mT0R表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 目的 構(gòu)建人mTOR基因的真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-mTOR，并進

10、行鑒定。方法 1.用RT-PCR法擴增mTOR的全長cDNA； 2.將空載質(zhì)粒pcDNA3.1和擴增的mTOR用分別用HindⅢ和BamHI雙酶切，玻璃奶回收，純化，連接； 3.接種于LB培養(yǎng)基中，運用酶切，進行PCR鑒定； 4.DNA測序分析。 結(jié)論 通過RT-PCR法擴增mTOR的全長cDNA，將空載質(zhì)粒PCDNA3.1和擴增的mTOR用分別用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，回收，純化，

11、連接，并運用PCR鑒定，DNA測序分析，構(gòu)建成功人mTOR基因的真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-mTOR。 論文4.pcDNA3.1-mTOR質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染膽管癌細胞 目的 研究信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路mTOR體外對膽管癌QBC939細胞生長的抑制作用，及對抑癌基因PTEN的負反饋調(diào)節(jié)影響。 結(jié)論 1.轉(zhuǎn)染成功后，膽管癌細胞的生長明顯增快，說明mTOR的增高可促進膽管癌細胞的生長，為mTOR的特異性的抑制劑的運用

12、提供了證據(jù)； 2.用攜帶有mTOR的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染QBC939細胞后，發(fā)現(xiàn)細胞的PTEN蛋白的表達增強；轉(zhuǎn)染前后PTEN的這種明顯的改變，說明mTOR可能通過PI3K/AKT/PTEN與mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路負反饋調(diào)節(jié)PTEN的表達。 第三部分：rapamycin和LY294002對膽管癌細胞凋亡抑制作用和化療增敏作用的研究 論文5.磷酸化抑制劑對PI3K/AKT/PTEN/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用及對膽管癌化療增敏作

13、用的研究 目的 運用磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑(phosphatidylinosito13-kinase，PI3-K)LY294002[22(42嗎啉基)282苯基24氫212苯并吡喃242酮]作用于膽管癌細胞系QBC939，探討抑制PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對膽管癌化療的增敏作用；并探討PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對膽管癌細胞的凋亡抑制作用。 結(jié)論 1.磷酸化抑制劑LY294002能有效的提高化療藥物5

14、-FU，MMC，CELECOXIB體外對QBC939細胞抑制作用的敏感性，通過抑制PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制其激活來增強膽管癌細胞的化療效果 2.聯(lián)合運用LY294002膽管癌細胞較單獨使用組凋亡率明顯增高，說明抑制PI3K介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對膽管癌細胞的凋亡有抑制作用。 論文6.mTOR特異性抑制劑rapamycin抑制膽管癌細胞生長的研究 目的 運用mTOR特異性抑制劑rapamycin作用于

15、膽管癌細胞系QBC939，探討抑制PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對膽管癌化療的增敏作用；同時探討PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對膽管癌細胞的凋亡抑制作用。 結(jié)論 1.mTOR特異性抑制劑rapamycin能有效的提高化療藥物5-FU，MMC，CELECOXIB體外對QBC939細胞抑制作用的敏感性，通過抑制mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制其活性來增強膽管癌細胞的化療效果 2.聯(lián)合運用rapamycin膽管癌細胞較單獨使用組