1、傳染性非典型肺炎，又稱嚴重急性呼吸綜合征(SevereAcuteRespiratorySyndrome，SARS)，是由SARS冠狀病毒感染引起的新發(fā)急性傳染病。2002年11月在我國廣東省首次發(fā)現(xiàn)后，至2003年6月，在短短時間里，蔓延肆虐于世界32個國家和地區(qū)，患者達八千多例，死亡七百多人，其中中國內(nèi)地5327例，死亡349例，廣東省21個地級市，有15市共報告1512病例，死亡58例。2004年初，廣東又發(fā)現(xiàn)4個新的散發(fā)病例，此外

2、，臺灣、新加坡、和我國還發(fā)生多起實驗室感染事故，SARS己成為二十一世紀首個對人類健康造成嚴重危害的新發(fā)傳染病。 由于SARS的臨床癥狀與其它呼吸道病毒性傳染病很難區(qū)分，實驗室檢測對其正確診斷極其重要。本研究采用包括病毒分離培養(yǎng)、血清學、分子生物學、基因芯片等多種SARS-CoV實驗室檢測方法，對SARS-CoV進行多項研究，包括：對SARS爆發(fā)初期的病原體進行分離鑒定；對SARS爆發(fā)期間報告病例進行篩查；對SARS血清抗體流行

3、情況和SARS病原體的可能來源進行研究；利用包括基因芯片在內(nèi)的各種最新檢測技術建立實驗室診斷方法，為SARS病例的確診提供依據(jù)。經(jīng)研究，得到以下結果。 1.SARS病原體的分離鑒定及指示病例(各地首發(fā)病例和死亡病例)檢測結果采用VeroE6細胞對在廣東省首先發(fā)現(xiàn)的SARS病人的咽拭子標本進行分離培養(yǎng)，并使用電鏡、間接免疫熒光(IFA)、巢式PCR及核苷酸序列測定等方法對分離物進行鑒定，應用ELISA、熒光PCR等技術對指示病例(

4、各地首發(fā)病例和死亡病例)進行檢測。實驗結果表明，在廣東省各地病人的咽拭子標本中，均檢測出SARS冠狀病毒；河源市、佛山市、肇慶市、中山市、東莞市、珠海市首發(fā)病例SARS冠狀病毒IgG抗體檢測結果均為陽性，全省9例臨床診斷為SARS死亡的病例的相關檢材檢測結果顯示4例PCR結果陽性，4例血清學檢測結果陽性，兩項指標結合證明7例與SARS感染有關，只有2例未能證明與SARS病毒感染有關。由此可見，廣東省首先發(fā)現(xiàn)的傳染性非典型肺炎的病原體是S

5、ARS冠狀病毒；各市臨床診斷的SARS首發(fā)病例和死亡病例確實與SARS冠狀病毒感染有關。 2.廣東省各類SARS報告病例標本實驗室檢測與臨床診斷結果的符合程度應用熒光定量PCR和巢式PCR技術檢測病人咽拭子中SARS病毒特異基因，應用ELISA和間接免疫熒光法檢測SARS病人恢復期血清中的SARS病毒IgG抗體。通過比較不同發(fā)病時間、有無明確接觸史的SARS臨床確診病人和疑似病人實驗室檢測結果與臨床診斷結果、流行病學資料之間的符

6、合程度，可以為臨床診斷提供更可靠的依據(jù)，達到更準確地確認或排除SARS病例的目的。實驗結果表明,2003年1、2、3、4、5月份，每月臨床確診病例PCR陽性率分別為：100％(2/2)、76.19％(16/21)、73.17％(30/41)、24.56％(14/57)、11.11％(2/18)，IgG抗體陽性率分別為100％(2/2)、78.57％(13/18)、58.33％(32/67)、30.30％(10/35)、9.52％(2/2

7、1)，陽性率逐月下降，4至5月份陽性率較低；1至4月份的臨床確診病例中，有明確接觸史的病例，PCR和IgG抗體陽性率分別為73.58％(39/53)、74.42％(32/43)，無明確接觸史的病例，PCR和IgG抗體陽性率分別為32.14％(27/84)、25.58％(22/86)，有無明確接觸史臨床確診病例陽性率有顯著性差異；4至6月份，凝似病人PCR和IgG抗體了的陽性率分別為11.89％(54/454)、7.78％(21/270)

8、，陽性率很低。以上結果說明,SARS爆發(fā)后期(4至5月)的臨床確診病例有部分并非由SARS病毒感染；無明確接觸史臨床確診病例比陽性率有顯著性差異，說明結合流行病學資料可以使臨床診斷更準確；凝似病例陽性率很低，說明大部分可能并非SARS病毒感染。必須綜合臨床癥狀、流行病學資料和實驗室檢測結果進行分析，才能得到更準確可靠的診斷結果，為客觀分析疫情發(fā)展趨勢提供科學依據(jù)。 3.廣東省不同人群SARS血清抗體流行情況及野生動物與SARS傳

9、播的相關性 在廣州等16市分別采集健康人群不同年齡組、果子貍等野生動物飼養(yǎng)經(jīng)營人員血清，用ELISA法檢測其SARS-CoVIgG抗體。通過比較各類人群SARS-CoV抗體陽性率，探討野生動物與SARS傳播的相關性及各類人群對SARS冠狀病毒的易感性。本研究共檢測各類人群血清10718份，陽性203份，陽性率為1.89％。其中，社區(qū)健康人群陽性率為0.68％(53/7783)；野生動物密切接觸人群陽性率為6.38％(123/19

10、28)；兩者陽性率有顯著性差異(x2=281,P＜0.01)；與SARS病人有密切接觸史的醫(yī)務人員陽性率為2.68％(27/1007)；社區(qū)健康人群中，來自SARS流行地區(qū)和非流行地區(qū)的陽性率分別為0.81％(44/5431)和0.38％(9/2352)，兩者有顯著性差異(x2=4.44，P＜0.05)；野生動物密切接觸人群中，來自SARS流行地區(qū)和非流行地區(qū)的陽性率分別為7.34％(116/1580)和2.01％(7/348)，兩者有

11、顯著性差異(x2=13.57，P＜0.01)；在與果子貍等野生動物密切接觸人群中，果子貍場飼養(yǎng)人員、野生動物市場銷售人員及有供應野生動物的酒樓工作人員陽性率分別為3.25％(4/123)、10.59％(100/944)和2.21％(19/861)，明顯比其它健康人群高；在肇慶等3市的健康人員中，成年人、小學生、幼兒園小孩陽性率分別為0.16％(7/3845)、1.04％(17/1632)和3.52％(19/540)，低年齡組的抗體陽性率

12、明顯高于成年組。以上結果說明，普通人群對SARS冠狀病毒普遍易感；野生動物與SARS冠狀病毒傳播有一定聯(lián)系；除果子貍外，市場中可能還有其它動物攜帶SARS冠狀病毒。 4.2003年12月至2004年1月廣東省新發(fā)SARS病例實驗室檢測結果 通過連續(xù)、系統(tǒng)地采集2003年12月-2004年1月廣東省新發(fā)4例SARS懷疑病例不同發(fā)病時間的各類標本，采用酶聯(lián)免疫法、間接免疫熒光法、中和試驗等血清學檢測技術和Real-timeP

13、CR分子生物學檢測技術檢測采集的標本，并對檢測結果進行分析，為SARS病例的實驗室診斷提供科學的依據(jù)。血清學檢測結果顯示，4例病例在發(fā)病后第6至8天，均可檢測到SARS-CoVIgM和IgG抗體；前3例病例SARS-CoV抗體有4倍或4倍以上增長；第4例病例SARS-CoVIgG抗體雖無4倍增長，但卻有明顯的抗體陽轉(zhuǎn)過程。同時采用ELISA法、IFA法和中和試驗進行抗體檢測，檢測結果基本一致。用Real-timePCR檢測咽拭等標本，從

14、病例1的3份咽拭標本中檢測到SARS-CoV核酸，其它標本SARS-CoV核酸檢測結果都為陰性。對陽性的標本，采用RT-PCR擴增出SARS-CoV的M、N、S基因，S基因序列和種系發(fā)生分析提示，該病毒與從廣東省果子貍中分離到的SARS毒株最接近。檢測結果證明這4例報告病例可以確認為SARS實驗室確診病例，該研究為SARS的實驗室診斷提供了完善的檢測方案，結果得到美國CDC等WHO參比實驗室的確認。 5.雙重限制性熒光標記技術在

15、SARS-CoV基因芯片檢測中的應用 分別采用傳統(tǒng)限制性熒光標記技術(直接采用熒光標記的通用引物標記)和雙重限制性熒光標記技術(熒光標記的通用引物和熒光標記的dNTP的雙重熒光標記,DoubleRestrictionFluorescentLabeling，DRFL)標記SARS-CoV微量核酸樣品，并進一步在同等條件下與基因芯片進行雜交、清洗和進行基因芯片的掃描檢測。通過對雜交結果的分析，比較兩種標記方法的標記效果，探索提高基因

16、芯片用于病原體檢測的靈敏度。結果顯示，以DRFL方法標記SARS基因片段，其熒光強度均值提高了3.5835倍。因此，DRFL技術能有效地提高單位分子標記片段的熒光強度值，并進一步提高了檢測的靈敏度，可用于微量病原體核酸樣品的基因芯片檢測。 6.SARS-CoV基因芯片在SARS檢測中的應用 采用SARS-CoV寡核苷酸基因芯片對200份臨床確診SARS病例的咽拭/咽漱液、401例非SARS感染的呼吸道病人的咽拭/咽漱液樣

17、品用雙盲法進行檢測。首先提取可能存在的病毒RNA，利用限制性熒光標記法標記，在同等條件下，進行基因芯片雜交、清洗和芯片掃描檢測。通過對雜交結果的數(shù)據(jù)分析，與臨床診斷和血清學的檢測結果比較，對該方法的靈敏度和特異性及應用于SARS早期診斷的可能性進行評價。對601份標本檢測的結果，靈敏度為71.50％，特異度為92.01％。對發(fā)病十天內(nèi)采集臨床確診SARS病例的標本，檢測的靈敏度為81.08％。結果表明，利用SARS-CoV寡核苷酸基因芯