1、　　本研究的目的：在前階段工作的基礎上，以原核表達系統(tǒng)為主，優(yōu)化表達體系及表達條件，用親和層析的方法，純化出可溶形式的目的蛋白。嘗試構建桿狀病毒表達載體(BAC-TO-BAC)，期望獲得溶解性更好、活性更接近于天然狀態(tài)的目標蛋白質，為下一步的動物免疫工作提供有活性的免疫原。 材料與方法1.構建重組表達載體，依據融合基因gD2-hIL-2全長序列，保留gD2基因的信號肽，設計一對特異性引物，PCR法擴增目的基因。雙酶切擴增片段和表

2、達載體，酶切產物連接，連接產物轉化入克隆菌株，篩選陽性克隆，抽提質粒，PCR、雙酶切和測序鑒定，應用電腦軟件，分析融合基因。2.目的蛋白的表達與優(yōu)化,重組表達質粒轉化入工程菌，隨機挑選克隆，擴大培養(yǎng)，誘導表達，SDS-PAGE和Westernblot法檢測。陽性克隆菌株擴大培養(yǎng)，IPTG誘導，對細胞各組分進行SDS-PAGE分析，判斷可溶性。改變溫度、IPTG濃度，不同條件下誘導目的蛋白表達，對胞質可溶組分進行SDS-PAGE分析，摸索

3、最佳表達條件。3.目標蛋白質純化,將單個轉化菌擴大培養(yǎng)，以最佳條件誘導表達，收集菌體，超聲波裂解，收集上清液。選用His-Bind親和純化試劑盒，經結合、漂洗和洗脫等步驟，分離融合蛋白，用特異性蛋白酶將標簽切掉，得到純化的目的蛋白。SDS-PAGE和Westernblot法檢測純化效果。標定最終體積、濃度，保存目的蛋白備用。4.重組桿狀病毒表達載體的構建雙酶切原核重組體和桿狀病毒供體質粒，將融合基因亞克隆入供體質粒，連接產物轉化感受態(tài)細