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![IFN-α調(diào)節(jié)NK細(xì)胞CD100表達(dá)在抗HCV感染中的分子機(jī)制研究.pdf_第1頁(yè)](https://static.zsdocx.com/FlexPaper/FileRoot/2019-3/19/12/e80c8427-781b-463d-8b9d-e23478d05587/e80c8427-781b-463d-8b9d-e23478d055871.gif)
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文檔簡(jiǎn)介
1、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染是全球性嚴(yán)重的健康問(wèn)題,目前約有1.3~1.7億人群感染HCV,其中70%~80%的患者發(fā)展為慢性。病毒持續(xù)感染,部分患者可發(fā)展為終末期肝病,如肝硬化和/或肝細(xì)胞癌。經(jīng)過(guò)聚乙二醇化干擾素(Pegylated interferon,Peg-IFN)-α聯(lián)合利巴韋林的標(biāo)準(zhǔn)化抗病毒治療,可使約55%人群獲得持續(xù)性病毒學(xué)應(yīng)答(sustained virological respons
2、e,SVR)。因此,充分認(rèn)識(shí)IFN-α抗病毒機(jī)制尤為重要。IFN-α直接抑制病毒復(fù)制外,還通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫活性清除HCV感染肝細(xì)胞,然而,IFN-α抗HCV免疫的潛在分子機(jī)制尚需進(jìn)一步闡明。
機(jī)體免疫應(yīng)答在抑制病毒復(fù)制和疾病進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。自然殺傷細(xì)胞(natural killer cells,NK)作為機(jī)體固有免疫系統(tǒng)中的重要組分,通過(guò)細(xì)胞毒性和分泌抗病毒因子如,IFN-γ等,在早期控制病毒感染。在急慢性HCV感染過(guò)程
3、中,NK細(xì)胞參與了抗病毒免疫;多數(shù)學(xué)者認(rèn)為,慢性HCV感染中NK細(xì)胞處于免疫抑制狀態(tài),機(jī)制尚未完全清楚。CD100,又稱(chēng)Sema4D,組成性表達(dá)于NK細(xì)胞和靜息T細(xì)胞。作為粘附分子,CD100通過(guò)與受體結(jié)合,增強(qiáng)效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞間粘附,對(duì)NK細(xì)胞功能進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)。然而,目前尚無(wú)關(guān)于CD100在慢性HCV感染中研究的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。
本研究選取75例慢性HCV感染者(未治療30例,應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)化抗病毒治療后獲得早期病毒學(xué)應(yīng)答者25例,獲
4、得SVR者20例)為研究對(duì)象。主要采用流式細(xì)胞術(shù)包膜染色檢測(cè)外周血NK細(xì)胞膜上CD100、CD69和腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)表達(dá)水平;以及采用ELISA檢測(cè)血清中可溶性CD100(soluble CD100,sCD100)水平。體外觀察了HCV感染和IFN-α刺激對(duì)CD100及受體Plexin-B1/B2表達(dá)
5、影響,并通過(guò)阻斷CD100-Plexin-B1/B2結(jié)合,觀察NK細(xì)胞殺傷活性變化,探討IFN-α介導(dǎo)抗病毒免疫的潛在分子機(jī)制及作用模式。
主要研究?jī)?nèi)容和方法:
1.慢性丙型肝炎患者NK細(xì)胞CD100表達(dá)及意義
有研究報(bào)道,在免疫缺陷病毒及漢坦病毒感染過(guò)程中,CD100參與了機(jī)體免疫調(diào)節(jié),但目前尚無(wú)HCV感染和CD100研究的相關(guān)報(bào)道。我們主要采用流式細(xì)胞術(shù)觀察了慢性HCV感染者(30例未治療患者)NK細(xì)胞
6、、亞群分布以及NK細(xì)胞膜分子CD100,CD69和TRAIL表達(dá)水平變化;同時(shí),采用ELISA法檢測(cè)了慢性HCV感染者血清中sCD100水平。并采用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)分析了NK細(xì)胞膜分子與臨床指標(biāo),谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)及HCV RNA水平之間的相關(guān)性。
2.HCV及IFN-α對(duì)CD100及受體Plexin-B1/B2表達(dá)影響
病毒感染可誘導(dǎo)NK細(xì)胞活化性受體(N
7、KG2D等)的配體在靶細(xì)胞表達(dá),促進(jìn)NK細(xì)胞活化,發(fā)揮殺傷功能。眾所周知,IFN-α是抗HCV感染治療藥物的主要組分,但是其通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫發(fā)揮抗病毒作用的分子機(jī)制尚不清楚。因此,我們選用K562及Huh7.5細(xì)胞做為本部分實(shí)驗(yàn)的靶細(xì)胞,首先采用qRT-PCR及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)K562及Huh7.5細(xì)胞是否表達(dá)CD100受體,Plexin-B1/B2。然后,體外采用不同感染復(fù)數(shù)(1,10,100)的HCV及不同濃度(0.01,0.1,1,
8、10,100,1000ng/ml)的IFN-α分別刺激健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)和Huh7.5細(xì)胞,在不同時(shí)間點(diǎn)觀察CD100及其受體Plexin-B1/B2表達(dá)水平的變化。
3.探索IFN-α調(diào)節(jié)NK細(xì)胞功能的分子作用機(jī)制
既往研究報(bào)道,IFN-α通過(guò)增強(qiáng)NK細(xì)胞功能,發(fā)揮抗HCV作用,但是相關(guān)分子機(jī)制尚不明確。我們首先采用流式細(xì)胞術(shù)觀察了接受 Peg-IFN-α聯(lián)合利巴韋林治療,獲得EVR及SVR者,外周
9、血NK細(xì)胞及亞群分布以及CD100,CD69及TRAIL在NK細(xì)胞表達(dá)變化;同時(shí)觀察了血清中sCD100水平變化,并分析了CD100,TRAIL與病毒學(xué)應(yīng)答的關(guān)系。體外采用K562,Huh7.5及HCV感染的Huh7.5細(xì)胞作為靶細(xì)胞,與分離的健康人NK細(xì)胞共培養(yǎng)12h,在IFN-α刺激下,觀察NK細(xì)胞功能變化;同時(shí)采用CD100阻斷實(shí)驗(yàn),觀察 NK細(xì)胞毒性及細(xì)胞因子IFN-γ分泌變化,探索CD100與其受體結(jié)合在調(diào)節(jié)NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞
10、過(guò)程中的作用。
主要研究結(jié)果如下:
1.慢性HCV感染者外周血中NK細(xì)胞亞群分布異常,表現(xiàn)為CD56dim NK亞群比率顯著下降,“失能”的CD56neg NK亞群異常增殖。
2.慢性HCV感染者血清中sCD100水平較健康對(duì)照者顯著降低;NK細(xì)胞CD100、CD69和TRAIL表達(dá)輕度異常,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
3.慢性HCV感染者NK細(xì)胞CD100及TRAIL表達(dá)分別與谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平呈正相關(guān),而與
11、HCV-RNA滴度呈負(fù)相關(guān)。
4.體外HCV感染及IFN-α治療均顯著影響CD100及其受體Plexin-B1/B2表達(dá)。
5.慢性HCV感染者經(jīng)過(guò)有效的IFN-α抗病毒治療后獲得EVR者,NK細(xì)胞CD100、CD69和TRAIL表達(dá)顯著上調(diào),sCD100血清水平升高;獲得SVR的患者,異常分布的NK細(xì)胞亞群、血清中sCD100及三種膜分子表達(dá)均恢復(fù)正常水平。
6.HCV可增強(qiáng)NK細(xì)胞毒性,表現(xiàn)為CD107
12、a表達(dá)升高,而對(duì)IFN-γ分泌無(wú)顯著影響;對(duì)不同靶細(xì)胞(K562、Huh7.5及HCV感染的Huh7.5細(xì)胞)應(yīng)答過(guò)程中,IFN-α顯著增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷活性,包括毒性及細(xì)胞因子分泌功能。
7.阻斷CD100與Plexin-B1/B2結(jié)合,明顯抑制NK細(xì)胞功能,表現(xiàn)為CD107a及IFN-γ表達(dá)下調(diào)。
綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)HCV感染通過(guò)下調(diào)NK細(xì)胞CD100表達(dá),降低效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞間接觸,抑制對(duì)靶細(xì)胞殺傷和病毒清除。根
13、據(jù)慢性HCV感染者CD100與ALT、HCV-RNA水平之間相關(guān)性,推測(cè)CD100可能參與了免疫介導(dǎo)的肝臟炎癥發(fā)生和病毒控制。在NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞免疫應(yīng)答中,IFN-α治療通過(guò)上調(diào)CD100、TRAIL、CD107a和IFN-γ等分子表達(dá),促使NK細(xì)胞活化,增強(qiáng)了對(duì)病毒感染肝細(xì)胞的殺傷,有助于清除HCV。探討其機(jī)制,發(fā)現(xiàn)CD100與受體Plexin-B1/B2結(jié)合在調(diào)節(jié)NK細(xì)胞功能中發(fā)揮了關(guān)鍵作用,為研制抗HCV感染新的藥物靶點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)
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