1、目的：分離、篩選出產(chǎn)具有較高轉(zhuǎn)酯活性脂肪酶的菌株,提取粗脂肪酶,用于催化生物柴油；通過PCR擴增的手段來獲得脂肪酶基因。 方法：以橄欖油為唯一碳源來富集培養(yǎng)、以RhodamineB為指示劑的平板進行初篩、搖瓶復(fù)篩來得到產(chǎn)脂肪酶菌株；利用滴定法、平板擴散法檢測酶活,最終篩選出脂肪酶活力高的菌株：借助于正交實驗得出其菌株的最佳產(chǎn)酶條件；利用丙酮法和(NH4)2SO4沉降法得到粗酶,催化以叔丁醇為溶劑、棉籽油與甲醇反應(yīng)生產(chǎn)生物柴油；通

2、過PCR擴增手段獲得脂肪酶基因,轉(zhuǎn)化DH5a菌,測序鑒定結(jié)果。 結(jié)果：1.進行了脂肪酶產(chǎn)生菌的大量篩選工作。經(jīng)以橄欖油為唯一碳源、RhodamineB為指示劑的平板初篩實驗,搖瓶復(fù)篩及酶活測定,最終篩選出一株所產(chǎn)生的脂肪酶可以催化轉(zhuǎn)酯反應(yīng)生產(chǎn)生物柴油的細菌B2。通過對B2進行形態(tài)學(xué)觀察及16S rDNA部分序列的系統(tǒng)進化發(fā)育分析,初步確定其屬于芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)；2.對篩選到的B2菌株液體搖瓶產(chǎn)脂肪酶的條件進

3、行了優(yōu)化。確定其最適產(chǎn)酶條件為：蔗糖1.0g,黃豆粉1.0g,蛋白胨0.5g,K2rtPO40.1g,MgSO4·7H2O 0.05g,水100mL,pH6.5;培養(yǎng)溫度為30,搖床轉(zhuǎn)速225r/min,搖瓶裝樣量為250mL三角瓶裝樣30mL,最佳培養(yǎng)時間48h；3.優(yōu)化產(chǎn)酶條件后脂肪酶活力提高,由最初的10.12U/mL增長到22.33U/mL增幅120.65％。通過丙酮法、(NH4)2SO4沉降法獲得脂肪酶,在叔丁醇作溶劑體系中,