1、在本論文中，主要從脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選、發(fā)酵條件優(yōu)化、誘變育種、對脂肪酶進行固定化和分離純化等幾方面進行研究： (1)進行了脂肪酶產(chǎn)生菌的大量篩選工作。經(jīng)以橄欖油為唯一碳源Rhodamine B 為指示劑的平板初篩實驗，搖瓶復篩及固定化脂肪酶粗酶催化轉(zhuǎn)酯反應生產(chǎn)生物柴油實驗，最終篩選出一株所產(chǎn)生的脂肪酶可以有效催化轉(zhuǎn)酯反應生產(chǎn)生物柴油的真菌G5。通過對G5進行形態(tài)學觀察，初步確定其屬于地霉菌屬(Geotrichum)。對其胞外粗酶

2、液酶基本性質(zhì)的研究表明：G5脂肪酶胞外粗酶液作用的最適溫度為40℃，最適作用pH為7.5，在50℃以內(nèi)和pH6.0～8.0之間有較好的穩(wěn)定性。 (2)對篩選到的G5菌株液體搖瓶產(chǎn)脂肪酶的條件進行了優(yōu)化。確定其最適產(chǎn)酶條件為：蔗糖1.0g，黃豆粉2.0g，蛋白胨0.5g， (NH<,4>)<,2>SO<,4> 0.25g，KH<,2>PO<,4>0.1g，MgSO<,4>·7H<,2>O 0.05g，橄欖油0.5ml，水100m

3、l，pH 6.0；培養(yǎng)溫度28℃，搖床轉(zhuǎn)速170min，搖瓶裝液量為300ml三角瓶裝液50ml，最佳培養(yǎng)時間68～72 小時。 (3)在確定了最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上，對于金屬離子、油脂的添加對G5生長及產(chǎn)酶的影響進行了研究。結(jié)果表明，Mg<,2+>和Fe<,2+>能夠促進其生長及產(chǎn)酶，其中Mg<'2+>的促進作用明顯；而Na<'+>、Mn<'2+>、Zn<'2+>有不同程度的抑制作用，Mn<'2+>的抑制作用較為明顯。在沒有

4、油脂存在下，該菌株產(chǎn)生的脂肪酶活較低，而在添加了天然油脂和合成油脂后，酶活大幅度提高，尤以橄欖油的誘導作用最為顯著。由以上結(jié)果推定G5菌株所產(chǎn)生的脂肪酶為誘導酶。 (4)用紫外線及EMS對G5進行誘變育種。結(jié)果證明EMS誘變效果較好。G5經(jīng)EMS誘變后傳代3次，酶活比出發(fā)菌株提高了178.6％。還需進一步的誘變實驗獲得穩(wěn)定遺傳的高產(chǎn)脂肪酶菌株。 (5)通過對 G5脂肪酶固定化酶條件的優(yōu)化，初步確定了以硅藻土為載體的固定化

5、G5脂肪酶的方法：固定化緩沖體系pH 7.0磷酸緩沖溶液，固定化溫度37℃，靜置固定化，固定化酶量與載體的比例(g／g)1:10。 隨后分別采用有溶劑體系和無溶劑體系兩種反應體系，考察了上述硅藻土固定化的G5脂肪酶對橄欖油、棉籽油和煎炸廢油與甲醇反應生成油酸甲酯的反應情況。實驗結(jié)果表明，G5脂肪酶對催化短鏈醇參與的轉(zhuǎn)酯化有一定效果，同時，此酶對催化煎炸廢油甲酯化同樣有效。在有溶劑反應體系中的轉(zhuǎn)化效果優(yōu)于無溶劑體系。(6)對G5