1、組織蛋白酶D(Cathepsin D)是許多真核生物細(xì)胞中廣泛存在的一種溶酶體天冬氨酸蛋白酶，可以降解胞內(nèi)和胞外蛋白質(zhì)。金屬基質(zhì)蛋白酶2(Matrixmetalloproteinase，MMP2)是一種鋅依賴性蛋白內(nèi)切酶，可以降解細(xì)胞外基質(zhì)，它們?cè)谏餀C(jī)體的病理過程中都發(fā)揮著重要作用。羅非魚是我國重要的淡水養(yǎng)殖魚類。本研究采用其作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用RACE、分子克隆以及熒光定量PCR技術(shù)等技術(shù)，對(duì)Cathepsin D基因與MMP2基因進(jìn)

2、行了克隆、功能預(yù)測(cè)與組織表達(dá)分析等。主要的研究結(jié)果如下:
　　(1)獲得了羅非魚Cathepsin D基因全長cDNA序列，長為1642bp，包括57bp的5'UTR、394bp的3'UTR和1191bp的編碼區(qū)。1191bp的編碼區(qū)共編碼396個(gè)氨基酸，包括1-18氨基酸組成的信號(hào)肽區(qū)、19-46氨基酸組成的前導(dǎo)肽區(qū)以及47-396氨基酸組成的成熟肽。Cathepsin D基因蛋白質(zhì)前體的理論等電點(diǎn)為6.1，分子量為43.2KD

3、，成熟蛋白的理論等電點(diǎn)為5.52，分子量為38KD。成熟蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)(instability index(Ⅱ))為34.24，屬于一種穩(wěn)定的蛋白，其脂肪指數(shù)(Aliphatic index)為79.09，總平均疏水指數(shù)(Grand average of hydropathicity(GRAVY))為-0.114，屬于親水性差脂溶性強(qiáng)的蛋白。通過氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)羅非魚cathepsin D基因在各物種之間比較保守，羅非魚與尖吻鱸的同

4、源性高達(dá)89％。與大多數(shù)硬骨魚不同，羅非魚cathepsin D蛋白的131、249和314氨基酸處存在3個(gè)N-glycosylation(N-X-S/T)位點(diǎn)。本研究還克隆獲得了羅非魚cathepsinD基因序列全長，為7628bp，通過對(duì)羅非魚cathepsin D基因序列與cDNA序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)羅非魚cathepsin D基因結(jié)構(gòu)與斑馬魚類似，都是由9個(gè)外顯子區(qū)和8個(gè)內(nèi)含子區(qū)構(gòu)成。
　　(2)通過克隆得到了3033bp的MMP

5、2基因片段，包含95bp的5UTR、967bp的3'UTR以及1971bp的編碼區(qū)。1971bp的編碼區(qū)共編碼656個(gè)氨基酸，包括1-29氨基酸處的信號(hào)肽區(qū)，43-97氨基酸處的前導(dǎo)肽區(qū)以及98-656氨基酸處的成熟肽。成熟的MMP2蛋白包括催化區(qū)、鉸鏈區(qū)和羧基末端區(qū)，催化區(qū)含有3個(gè)纖維連接蛋白Ⅱ型結(jié)構(gòu)域，羧基末端區(qū)含有四個(gè)類血紅素結(jié)合蛋白重復(fù)。MMP2基因蛋白質(zhì)前體的理論等電點(diǎn)為5.01，分子量為74.33KDa。成熟的MMP2蛋白的

6、理論等電點(diǎn)為4.91，分子量為70.99KDa，不穩(wěn)定系數(shù)為29.16，屬于一種穩(wěn)定的蛋白，其脂肪指數(shù)為57.11，總平均疏水指數(shù)為-0.529，屬于親水差的蛋白。通過氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)MMP2基因在脊椎動(dòng)物間比較保守，其中羅非魚與紅鰭東方純的同源性高達(dá)89％。
　　(3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果表明，cathepsin D基因在健康羅非魚12個(gè)組織中都有表達(dá)，但它們的表達(dá)量差異顯著(P＜0.05)。在頭腎和脾中表達(dá)量較高，腸、

7、腦和血液中次之，心、鰭、眼、肌肉、性腺、肝中表達(dá)量較低，頭腎的表達(dá)量約為心的13倍，脾的表達(dá)量約為心的7倍。對(duì)羅非魚進(jìn)行人工攻毒嗜水氣單胞菌后，cathepsin D基因的表達(dá)量在脾、腸、肝和頭腎中均發(fā)生了上調(diào)，分別在5h、24h、48h和48h到達(dá)峰值，并隨后開始下降。
　　MMP2基因在健康羅非魚11個(gè)組織中均有表達(dá)，但表達(dá)量有顯著差異(P＜0.05)。在雄性中的精巢、心和眼中表達(dá)量較高，肌肉和鰭次之，肝臟中較低。精巢的表達(dá)量

8、約為肝的14.47倍，心和眼的表達(dá)量分別為肝的8.12倍和7.04倍。人工使羅非魚感染嗜水氣單胞菌后MMP2基因在脾、頭腎和肝中的表達(dá)量發(fā)生明顯上調(diào)，分別在5h、24h和48h到達(dá)峰值，隨后也開始下降，并漸漸趨于正常水平。
　　研究結(jié)果說明，隨著外來致病菌的入侵，免疫相關(guān)器官內(nèi)cathepsin D和MMP2基因表達(dá)量發(fā)生先升后降的顯著變化，可能與機(jī)體啟動(dòng)清除致病菌的過程有關(guān)，說明cathepsin D和MMP2基因在羅非魚天然免