1、IRAK1(IL-1 receptor-associated kinase)和Tollip(Toll-interacting protein)是哺乳動(dòng)物天然免疫TLR/IL-1R途徑中重要的信號(hào)分子,在TLR/IL-1R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過(guò)程中扮演著重要的角色。IRAK1是該信號(hào)途徑中重要的激酶分子,而Tollip則在TLR/IL-1R信號(hào)途徑中起負(fù)調(diào)控的作用。雖然在鯉魚中已經(jīng)克隆得到了幾種TLR,但是對(duì)鯉魚感染刺激后TLR信號(hào)通路作用機(jī)制的研

2、究尚不明確。
　　在本研究中,我們根據(jù)IRAK1和Tollip的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物,先后克隆得到了鯉魚IRAK1和Tollip的部分cDNA片段,并通過(guò)RACE技術(shù)分別克隆得到了IRAK1和Tollip的全長(zhǎng)cDNA序列。鯉魚IRAK1的cDNA序列全長(zhǎng)為2800bp,它包含138bp的5’非編碼區(qū)(5’UTR),2109bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)和553bp的3’UTR。在終止密碼子TAG下游有一個(gè)多聚腺苷酸化信號(hào)AATAAA和14

3、 bp的多聚腺苷酸尾(poly(A)tail)。鯉魚IRAK1 cDNA的ORF區(qū)域編碼702個(gè)氨基酸殘基的蛋白。用SMART程序進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析,結(jié)果顯示,IRAK1含有一個(gè)死亡結(jié)構(gòu)域(Asn20-Lys93),一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸激酶催化結(jié)構(gòu)域(Phe186-Leu487)。而鯉魚Tollip的cDNA全長(zhǎng)為1284bp,包含92bp的5’UTR,831 bp的ORF和361bp的3’UTR。在終止密碼子TAG下游有一個(gè)多聚腺苷酸化

4、信號(hào)ATTAAA和10 bp的多聚腺苷酸尾(poly(A)tail)。鯉魚Tollip cDNA的ORF區(qū)域編碼276個(gè)氨基酸殘基的蛋白。采用SMART server進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析,結(jié)果顯示,鯉魚Tollip含有一個(gè)TBD結(jié)構(gòu)域(Met1-Arg54),一個(gè)C1結(jié)構(gòu)域(Leu55-Trp151)和一個(gè)CUE結(jié)構(gòu)域(Cys231-Ala273)。
　　我們對(duì)鯉魚IRAK1和Tollip所翻譯的多肽序列與其他物種的IRAK1和To

5、llip的多肽序列進(jìn)行了多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析,發(fā)現(xiàn)鯉魚IRAK1與草魚的IRAK1相似度最高,為84.5％,在進(jìn)化關(guān)系上鯉魚IRAK1與草魚IRAK1親緣關(guān)系最近,兩者同屬于IRAK1亞家族,并且位于同一分支上。而鯉魚Tollip與草魚和斑馬魚的Tollip相似性最高,分別為93.1%和93.8%,在進(jìn)化關(guān)系上鯉魚Tollip和硬骨魚的Tollip位于同一分支上,與草魚和斑馬魚Tollip的親緣關(guān)系最近。
　　隨后我們采用qR

6、T-PCR對(duì)正常鯉魚中IRAK1和Tollip基因進(jìn)行組織特異性表達(dá)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)鯉魚IRAK1和Tollip基因在所有檢測(cè)的組織內(nèi)均表達(dá)。其中,IRAK1 mRNA在鰓中的表達(dá)量最高,其次為腦、皮膚、后腸、口腔上皮、脾、前腸、頭腎和肝臟,而在性腺和肌肉中的表達(dá)量較低。同時(shí),我們看到,Tollip mRNA在腦中具有最高的表達(dá),其次為性腺、鰓、脾、頭腎、后腸、肌肉、前腸和肝臟,其表達(dá)量在口腔上皮和皮膚中則較低。
　　為了研究鯉魚I

7、RAK1和Tollip在抵抗細(xì)菌感染中的功能,我們分析了鰻弧菌腹腔注射刺激前后,鯉魚免疫相關(guān)組織中IRAK1和Tollip mRNA表達(dá)水平的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)鯉魚IRAK1和Tollip在刺激后所有免疫相關(guān)組織中的表達(dá)量均有所上升,其中鯉魚IRAK1在刺激后鯉魚的肝臟中升高最明顯,脾臟次之,前腸,后場(chǎng),鰓和皮膚,緊隨其后,頭腎雖有所升高,但是變化不明顯。而Tollip則在脾臟中的表達(dá)量變化最大,皮膚和肝臟次之,其次是鰓和后腸,前腸和頭腎雖

8、然表達(dá)量有所升高,但是變化不明顯。說(shuō)明鯉魚IRAK1和Tollip在抵抗鰻弧菌的感染中發(fā)揮作用。
　　為了進(jìn)一步研究鯉魚IRAK1和Tollip在抵抗病毒感染中的功能,我們采用PolyI:C腹腔注射鯉魚后,分析了不同免疫相關(guān)同組織中IRAK1和Tollip mRNA表達(dá)水平的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),鯉魚經(jīng)polyI:C刺激后,IRAK1和Tollip mRNA表達(dá)水平在各免疫相關(guān)組織中均明顯增加,其中鯉魚IRAK1在刺激后鯉魚的肝臟中升高

9、最明顯,脾臟次之,其次是鰓,前腸,后腸和皮膚,在頭腎中則升高不明顯。而Tollip則在脾臟中的表達(dá)量變化最大,皮膚和肝臟次之,其次是前腸后腸和鰓,頭腎中的變化量最小,說(shuō)明鯉魚IRAK1和Tollip在抵抗病毒的感染中發(fā)揮作用。初步研究了IRAK1和Tollip在鯉魚抗擊病原體感染中的作用機(jī)制。
　　這些結(jié)果表明Tollip和IRAK1確實(shí)存在于鯉魚中,并為鯉魚TLR信號(hào)的研究提供了新的視野,這將有助于我們進(jìn)一步研究鯉魚中的TLR信