1、目的:以往白血病的細胞免疫治療的細胞來源均為緩解期的白血病患者，未緩解或初治白血病患者外周血存在一定比例的白血病細胞，能否激發(fā)出抗腫瘤CIK細胞值得進一步探討。分別收集緩解期急性白血病患者、未緩解白血病患者的外周血，提取單個核細胞，培養(yǎng)樹突狀細胞和細胞因子誘導的殺傷細胞，觀察DC細胞與CIK細胞的增殖能力、免疫膜標變化以及抗白血病細胞的效應?；旌吓嘤龢渫粻罴毎图毎蜃诱T導的殺傷細胞，比較緩解期與未緩解期患者來源的CIK細胞特性變化和殺

2、滅瘤細胞活性，探索生物過繼醫(yī)療收獲效應細胞的較合理方法。
　　方法:DC細胞的培養(yǎng):采取未緩解期和緩解期急性白血病患者的外周血，經(jīng)肝素抗凝后，用H-F(Hypaque-Fieoll)淋巴細胞分離液（相對密度為1.077±0.001），分離獲得單個核細胞(mononuclearn cells，MNC)。然后用RPMI1640培養(yǎng)液洗滌3次，調(diào)整細胞濃度至4×106/ml，孵育4小時后，取貼壁細胞，加入新鮮RPMI1640培養(yǎng)基，輕輕

3、吹打，將瓶壁上細胞吹起，離心洗滌，計數(shù)板計數(shù)細胞，使細胞濃度為1×106/ml，然后用含有10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，并加入細胞因子，使重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(rhGM-CSF)濃度為1000U/ml、重組人白細胞介素-4(rhIL-4)濃度為1000 U/ml。然后放入培養(yǎng)箱中培育，適時補充培養(yǎng)基和細胞因子，并計數(shù)。在DC細胞培養(yǎng)第6天，加重組人腫瘤壞死因子-a(rhTNF-a)，使?jié)舛葹?000U/ml，促

4、進DC細胞成熟。
　　CIK細胞的體外培養(yǎng):同上來源的細胞經(jīng)過單個核細胞的分離，然后用RPMI1640培養(yǎng)液洗滌3次，調(diào)整細胞濃度至4×106/ml，孵育4小時后，收集懸浮的細胞，用含10％小牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)BS)RPMI1640液將細胞濃度調(diào)整至1×106/ml，經(jīng)37℃、5％CO2培養(yǎng)，分別于第1天、第2天加入不同的細胞因子，以后隔日更換新的培養(yǎng)液并計數(shù)，同時補充加入重組人白細胞介素-2(rh-in

5、terleukin-2，rhIL-2)。培育第7天，用臺盼藍排斥法染色DC細胞和CIK細胞，計數(shù)活細胞，用完全培養(yǎng)基（含10％胎牛血清的RPMI1640液）調(diào)整DC細胞濃度為1×106/ml，CIK細胞濃度為5×106/ml，按照1∶5比例混合，繼續(xù)培養(yǎng)，在培養(yǎng)的第1天、第9天、第12天、第15天收集共培養(yǎng)細胞，計數(shù)，測定生物學活性。
　　結(jié)果:
　　1緩解組與未緩解組來源的DC-CIK細胞增殖能力的比較
　　通過觀察

6、混合培育樹突狀細胞與細胞因子誘導的殺傷細胞后，比較緩解組與未緩解組細胞的增生性能、細胞毒性、表面標識分子。在溫箱中孵育過的貼壁單個核細胞，經(jīng)GM-CSF和IL-4誘導成樹突狀細胞，培育中細胞外形發(fā)生鮮明變化，細胞量亦有明顯增加。培育第二天細胞體積增長，邊緣發(fā)出胞漿突起，外形不規(guī)整，隨著培育時間的延長，細胞邊緣突起增多，變長，并成簇成團生長（見圖1）。
　　非粘附單個核細胞在多種細胞因子的刺激誘導下，部分淋巴樣細胞明顯擴增成CIK細

7、胞，并逐漸形成細胞團塊;細胞因子誘導的細胞，最初散在均勻分布，個頭小，亮而圓，形體較一致（見圖2）。在培養(yǎng)的第4天，細胞形態(tài)開始呈現(xiàn)出不規(guī)則形，并呈團簇生長（見圖3）。從培養(yǎng)的第6天起，細胞明顯增殖，成叢或以集落狀態(tài)生長，并懸浮于培養(yǎng)基中（見圖4）。隨著培養(yǎng)時間延長，細胞叢和細胞集落數(shù)增多。
　　在細胞培養(yǎng)的第6天將DC細胞與CIK細胞共培養(yǎng)得DC-CIK細胞，比較各組的免疫表型和生物活性的變化。細胞培養(yǎng)第9天，經(jīng)臺盼藍排斥法活細

8、胞計數(shù)，緩解組DC-CIK細胞的增殖倍數(shù)為(16.39±1.89)，未緩解組DC-CIK增生了(17.0±2.16)倍;第12天，緩解組DC-CIK細胞數(shù)為原來的(42.6±3.93)倍，未緩解組是原來的(40.2±2.97)倍。第15天，DC-CIK（緩解組）細胞總數(shù)為原來的(65.2±1.81)倍，未緩解組細胞數(shù)擴增了(65.4±2.56)倍。分析比較同一組細胞的增殖倍數(shù)隨時間的增加均有統(tǒng)計學意義。（見表1）即兩組CIK細胞均在樹突

9、狀細胞輔助下快速增殖，增殖速度差別不大。鏡下可見DC與較多的CIK細胞聚集成團（見圖5），呈團塊生長。
　　2緩解組與未緩解組來源的DC-CIK細胞分子表型的變化
　　分別收集培養(yǎng)第1天、第9天、12天及15天的兩組培養(yǎng)細胞，經(jīng)流式細胞儀檢測細胞表型分析。結(jié)果顯示:分離細胞當天測得緩解組和未緩解組細胞的免疫表型結(jié)果如下:CD3+CD8+細胞分別為(23.4±5.36)％，(21.8±7.32)％，CD3+CD56+細胞分別為

10、(3.81±1.35)％，(4.01±1.63)％。培養(yǎng)的第9天、12天、15天培養(yǎng)物的免疫表型檢測結(jié)果如下:緩解組CD3+CD8+細胞分別為(53.0±1.58)％，(71.2±2.59)％，(87.5±1.29)％，CD3+CD56+細胞分別為(31.4±1.14)％，(49.0±2.58)％，(63.8±1.98)％;未緩解組CD3+CD8+細胞分別為(54.0±2.98)％，(71.4±1.82)％，(88.6±3.4)％，CD

11、3+CD56+細胞分別為(32.4±2.24)％，(50.0±3.2)％，(66.8±4.1)％（見表2）可見，在DC-CIK的培養(yǎng)過程中，其細胞免疫表型為CD3+CD8+和CD3+CD56+細胞比例明顯增高，(p＜0.05)，但兩組DC-CIK間免疫表型的變化不顯著，P值均大于0.05。
　　3緩解組和未緩解組來源DC-CIK細胞殺傷活性比較
　　采集培養(yǎng)15天的DC-CIK細胞做殺傷實驗，以緩解期和未緩解期來源的DC-C

12、IK細胞作為效應細胞，K562細胞為靶細胞，在效靶比5∶1～20∶1范圍內(nèi)，比較兩者的殺傷活性。緩解組在效靶比分別為5∶1，10∶1，20∶1所對應的殺傷活性結(jié)果為(21.7±4.64)％，(28.9±3.79)％，(42.64±3.25)％，未緩解組取相同的效靶比，相應的殺傷活性分別為(30.40±2.73)％，(42.38±3.20)％，(57.49±2.87)％（見表3）。未緩解組來源的DC-CIK細胞對K562細胞殺傷力略強于緩

13、解組，但經(jīng)過統(tǒng)計學分析，相同效靶比條件下二者的殺傷力的差異不明顯，P值均大于0.05。
　　4未緩解組來源DC-CIK細胞培養(yǎng)前后白血病細胞比較
　　細胞涂片法計數(shù)未緩解患者外周血中的原始細胞，培養(yǎng)前平均值為(83±3.1)％，流式測得CD34+細胞占(4.23±3.48)％;混合培養(yǎng)一段時間后再涂片觀察，顯微鏡下未見原始細胞，用流式細胞儀檢測表達CD34+的細胞比例降至平均(0.1±0.05)％。比較結(jié)果，培養(yǎng)后的細胞中原

14、始細胞較培養(yǎng)前明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義，即P＜0.05。
　　5未緩解組來源DC-CIK細胞殺傷活性的特異性比較
　　收集未緩解組培養(yǎng)的DC-CIK細胞作為效應細胞，分別以K562細胞和凍存的患者單個核細胞為靶細胞，在效靶比5∶1～20∶1范圍內(nèi)，比較兩者的殺傷活性。未緩解組在效靶比分別為5∶1，10∶1，20∶1時對K562細胞的殺傷活性結(jié)果為(30.48±2.94)％，(42.66±3.46)％，(57.22±4.23

15、)％，同時檢測在相應效靶比下，對凍存的患者的單個核細胞的殺傷為(35.23±3.43)％，(47.65±5.92)％，(67.29±7.95)％，（見表4），經(jīng)過統(tǒng)計學分析，相同效靶比條件下二者的殺傷力有顯著性差異。
　　結(jié)論:
　　1應用未緩解患者的外周血單個核細胞，同樣可以培養(yǎng)出DC-CIK細胞，與緩解組來源的DC-CIK細胞比較，增殖活性無顯著性差異。
　　2未緩解組和緩解組來源的DC-CIK細胞中，CD3+CD