1、砂梨(Pyrus pyrifolia Nakai)原產(chǎn)于我國(guó)中部、南部和西部各省,適于在溫暖多雨地區(qū)栽培,是原產(chǎn)于中國(guó)的四個(gè)梨栽培種之一,具有耐熱、抗旱、抗火疫病等優(yōu)良性狀。但其果實(shí)大多貯藏性差。如何提高果實(shí)耐貯性是解決好砂梨產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵問(wèn)題。目前的研究主要是針對(duì)砂梨果實(shí)的生理特點(diǎn),通過(guò)改善果實(shí)的貯藏條件和采用一些乙烯抑制劑來(lái)延長(zhǎng)砂梨果實(shí)的貨架期,不能解決根本問(wèn)題。我們以‘若光’梨為材料,研究適于‘若光’梨葉片離體再生的培養(yǎng)基的種類以及

2、激素配比,克隆‘若光’果實(shí)中與成熟相關(guān)的基因并構(gòu)建其RNA干擾載體,將構(gòu)建的載體分別進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的梨、番茄、煙草轉(zhuǎn)化,研究干擾基因在植物體內(nèi)的表達(dá)特性,為將來(lái)獲得耐貯砂梨新種質(zhì)提供了基礎(chǔ)。 1、為了獲得‘若光’梨高效的葉片離體再生體系,和為‘若光’梨的耐貯基因工程研究提供條件,以‘若光’梨葉片為材料,研究了不同激素的種類與濃度組合對(duì)砂梨葉片離體再生的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),以NN69為基本培養(yǎng)基,附加TDZ 1.0 mg/L+IBA

3、0.15 mg/L+AgNO3 0.1 mg/L處理‘若光’梨葉片,暗培養(yǎng)21d后,再置于光照條件下培養(yǎng)30d,‘若光’梨葉片不定芽再生頻率達(dá)到了63.2％。 2、根據(jù)已登錄的砂梨ACO3(GenBank Accession No.AB042107)序列設(shè)計(jì)并合成一對(duì)特異引物,以‘若光’梨葉片總DNA為模板,利用染色體步移技術(shù)擴(kuò)增基因的上游調(diào)控序列?；厥赵撈尾⒖寺〉絧MD19-T載體上,測(cè)序后去除接頭和基因編碼序列,得到一段長(zhǎng)

4、715bp的上游序列。登陸PLACE數(shù)據(jù)庫(kù)在線進(jìn)行植物DNA順式作用元件預(yù)測(cè)與分析,起始位點(diǎn)的上游89bp處有一個(gè)TATA-Box核心啟動(dòng)子元件。另外,序列還存在多個(gè)特異調(diào)控基因表達(dá)的元件。初步判斷其為砂梨果實(shí)中ACC氧化酶基因的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。 3、以‘若光’梨成熟果實(shí)為材料,提取總RNA。在ACC氧化酶基因(ACO)mRNA序列同源性較高區(qū)域,用Primer premier5軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物,利用RT-PCR克隆得到了40

5、1bp長(zhǎng)的片段。經(jīng)過(guò)測(cè)序和核苷酸、氨基酸比對(duì),發(fā)現(xiàn)與登錄的ACC氧化酶基因(ACO3)同源性達(dá)到99％。據(jù)此判斷,得到的片段為砂梨的ACC氧化酶基因序列。根據(jù)序列設(shè)計(jì)兩對(duì)分別加了不同酶切位點(diǎn)的正、反基因的特異上下游引物,擴(kuò)增出ACO的正、反義基因。將ACO反義基因、與副球菌中類胡蘿卜素合成有關(guān)的間隔基因YYT(GenBank with accession numbef AY345165)以及ACO正義基因三個(gè)片段串聯(lián)在一起,并克隆到T載

6、體.經(jīng)測(cè)序鑒定正確后,雙酶酶切下目標(biāo)片斷并插入到植物表達(dá)載體中,構(gòu)建成能夠表達(dá)ACC氧化酶基因的雙鏈RNA的植物載體pYF028。 4、為了研究ACO干擾基因在植物體中的表達(dá)特性,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化番茄子葉,將侵染的520個(gè)外植體先經(jīng)MS+ZT 1mg/L+IAA 0.5 mg/L+Km 50 mg/L+250 mg/LCef+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L(pH 5.8)篩選培養(yǎng)基,初步篩選出Km抗性芽。將篩選出的抗性芽再

7、經(jīng)過(guò)2次繼代培養(yǎng),共得到34個(gè)抗性株系。將抗性株系轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基MS+IAA 0.5 mg/L+Km 50 mg/L+Cef250mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7g/L(pH5.8)中生根,經(jīng)過(guò)30d的生根培養(yǎng),共得到了6個(gè)生根株系。經(jīng)過(guò)GUS染色、PCR、RT-PCR檢測(cè)驗(yàn)證。初步證實(shí),干擾基因已經(jīng)整合到番茄的基因組中。進(jìn)一步進(jìn)行其乙烯發(fā)生量的檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)干擾基因番茄植株的乙烯釋放量顯著高于對(duì)照。 5、以‘若光’梨成熟

8、果實(shí)為材料,提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)脂氧合酶氨基酸保守區(qū)設(shè)計(jì)1對(duì)簡(jiǎn)并引物,采用RT-PCR克隆到1段長(zhǎng)827bp的cDNA序列。經(jīng)Blast比對(duì)和DNAstar軟件聚類分析,結(jié)果表明,由該序列推導(dǎo)出的氨基酸序列含有脂氧合酶氨基酸保守結(jié)構(gòu)域,與馬鈴薯脂氧合酶基因的氨基酸序列相似性達(dá)到77.5％。判斷為砂梨脂氧合酶基因片段,命名為L(zhǎng)OX1,并將序列登錄到GenBank,登錄號(hào)為EF215448。根據(jù)RNAi載體的構(gòu)建原則,選擇L

9、OX1中一開(kāi)放閱讀框設(shè)計(jì)攜帶酶切位點(diǎn)的特異引物,通過(guò)PCR擴(kuò)增LOX1正、反向基因片段,再與YYT間隔區(qū)串連,插入植物表達(dá)載體pYF7713中的相應(yīng)位置。構(gòu)建了干擾砂梨LOX基因表達(dá)的RNAi植物雙元表達(dá)載體pYL028。 6、為了研究干擾基因在植物體中的表達(dá)特性,我們將構(gòu)建好的‘若光’梨LOX1干擾表達(dá)載體(pYL028),通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草葉片；將侵染的113個(gè)外植體先經(jīng)MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.1 m

10、g/L+Km 50 mg/L+Cb 250 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L(pH 5.8)的篩選培養(yǎng)基培養(yǎng),初步篩選出Km抗性芽?？剐匝吭俳?jīng)2次繼代培養(yǎng),共得到16個(gè)抗性株系。將抗性株系轉(zhuǎn)到1/2MS+IBA0.1 mg/L+Cb 250 mg/L+Km 50 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L(pH 5.8)的生根培養(yǎng)基中生根,經(jīng)過(guò)30d的生根培養(yǎng),共得到了5個(gè)生根株系。經(jīng)過(guò)GUS染色、PCR、RT-PCR檢測(cè)驗(yàn)證

11、,初步證實(shí),干擾基因已經(jīng)整合到煙草的基因組中。進(jìn)一步檢測(cè)脂氧合酶及相關(guān)酶的活性,結(jié)果顯示,在低溫脅迫條件下,轉(zhuǎn)基因植株與未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照植株相比,LOX酶的活性被抑制37.8％；SOD、CAT和POD酶活性顯著升高。MDA的含量顯著降低。 7、根據(jù)脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)氨基酸保守區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物,采用RT-PCR技術(shù)從‘若光’梨成熟果實(shí)中克隆到一段cDNA特異片段,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑單克隆測(cè)