1、研究背景：
　　慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD)是世界范圍內嚴重危害人類健康的常見和多發(fā)疾病，當前其發(fā)病機制未明，防治形勢非常嚴峻。氣道粘液高分泌是除慢性氣道炎癥和肺氣腫外COPD的又一特征性病理改變，是COPD發(fā)病率和死亡率升高的獨立危險因素，因此氣道粘液高分泌的發(fā)生機制研究，已成為COPD防治領域的關注熱點。多種與COPD發(fā)病密切相關的因素，如香煙煙霧、病

2、原微生物及其產物（如脂多糖、綠膿菌素），炎癥細胞（如中性粒細胞、嗜酸性粒細胞）及炎癥因子（如IL-8、IL-1β、TNF-α、IL-4）等，可直接或間接作用于氣道上皮細胞，在氣道粘液高分泌的形成和維持中發(fā)揮重要作用。相關的機制研究表明，表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)在上皮細胞的粘液分泌過程中發(fā)揮重要介導作用，而在其下游諸多信號分子中，MAPK家族成員ERK占據了非常重要的地

3、位，可形成EGFR-ERK通路。另外，金屬蛋白酶家族的某些成員也參與到粘蛋白MUC5AC（氣道粘液的一種主要大分子成分）的誘導過程中，如細胞膜上的腫瘤壞死因子α轉換酶(TNF-αconvertingenzyme，TACE)可剪切錨定在胞膜表面的pro-TGF-α，pro-amphiregulin，pro-HB-EGF等前體分子，釋放出可溶性的活性成分TGF-α，amphiregulin(AR)和HB-EGF，這些活性成分作為EGFR的配

4、體與之結合，通過配體-受體反應轉激活EGFR及下游信號通路，促進粘蛋白的合成和分泌。在香煙提取物(cigarette smoke extract，CSE)、中性粒細胞彈性蛋白酶(human neutrophil elastase，HNE)、活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)、脂多糖和綠膿菌素、曲霉菌等誘導氣道上皮細胞粘蛋白生成的過程中，TACE介導的EGFR轉激活作用已得到證實。
　　近年來，天然免

5、疫系統(tǒng)在COPD發(fā)病中的作用受到重視。Cathelicidin是人類內源性抗菌肽（anti microbial peptides，AMPs）的重要成員，是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，廣泛表達于機體多種組織。Cathelicidin具有多種生物學功能，除具有針對細菌、真菌、病毒等的抗微生物活性外，還在炎癥/免疫反應、損傷修復、細胞增殖和凋亡等病理生理過程中發(fā)揮重要的調控作用。人們注意到，Cathelicidin的調控活性與COPD發(fā)病的多

6、個病理環(huán)節(jié)有較好的契合，推測Cathelicidin可能在COPD的發(fā)病中占有一定地位。相關研究表明，COPD患者誘導痰、肺組織、支氣管肺泡灌洗液以及呼吸道上皮襯液中LL-37(Cathelicidin發(fā)揮作用的活性片段)的表達均顯著升高，提示LL-37與COPD的發(fā)病密切相關;我們的前期研究則發(fā)現，LL-37能誘導氣道上皮細胞和肺泡上皮細胞凋亡并伴隨IL-8、TNF-α等炎癥因子的釋放，提示LL-37可能在COPD發(fā)病的氣道炎癥和肺氣

7、腫形成兩個病理過程中發(fā)揮作用。然而，對于COPD的氣道粘液高分泌過程，LL-37是否在其中發(fā)揮作用尚不得而知。有文獻報道，LL-37可通過轉激活EGFR-ERK信號通路，活化氣道上皮細胞，促進炎癥因子IL-8的釋放;LL-37還可通過MAPK途徑上調人結腸上皮細胞粘蛋白基因的表達，增加粘蛋白合成。根據LL-37在COPD患者氣道內的高表達狀態(tài)以及LL-37激活相關信號通路的能力，我們提出假設，推測氣道局部高水平的LL-37能夠促進氣道粘

8、蛋白的生成，從而參與氣道粘液高分泌狀態(tài)的形成，并因此在COPD的發(fā)病及病情進展中發(fā)揮重要作用。
　　為驗證這一假設，本研究在人體標本和體外細胞兩個層面探討了LL-37對COPD氣道粘液分泌的影響及其可能的分子機制。
　　目的：
　　觀察COPD患者小氣道局部內源性抗菌肽Cathelicidin/LL-37和粘蛋白的表達情況，探討Cathelicidin/LL-37對人氣道上皮細胞粘蛋白MUC5AC的體外誘導效應及相關分

9、子機制，初步闡明Cathelicidin/LL-37在COPD氣道粘液高分泌中的作用。
　　方法：
　　1.研究對象和一般資料收集
　　選取因肺外周腫瘤需行肺葉切除術的穩(wěn)定期COPD患者15例(COPDgroup)、肺功能正常的吸煙者15例(NormalSmokergroup，NSgroup)和肺功能正常的不吸煙者15例(NormalNon-smokinggroup，NNgroup)，術前收集性別、年齡、吸煙史等一般資

10、料，并行常規(guī)肺通氣功能檢查，記錄一秒量(forcedexpiratoryvolumein1sec，FEV1)和一秒率(FEV1/forcedvolumecapacity,FEV1/FVC)。COPD診斷的確立根據GOLD(2010)標準。
　　2.人體組織病理研究
　　術中收集手術切除的外周肺組織，距腫瘤邊緣5cm以上，以排除腫瘤的影響。對肺組織切片進行HE染色、糖原過碘酸雪夫(PeriodicAcid-Schiffstai

11、n，PAS)染色和免疫組織化學染色，比較3組標本的形態(tài)學特征以及外周小氣道上皮LL-37和粘蛋白MUC5AC的表達情況，分析LL-37、粘蛋白MUC5AC與肺通氣功能指標，以及LL-37與粘蛋白MUC5AC之間的相關性。
　　3.體外研究
　　3.1體外培養(yǎng)人支氣管上皮NCI-H292細胞，香煙提取物(cigarettesmokeextract，CSE)和LL-37合成肽分別以不同刺激濃度、不同刺激時間作用于細胞，MTT法檢

12、測CSE和LL-37合成肽對細胞活力的影響，選取細胞活力不低于80％的刺激模式為后續(xù)實驗提供參考范圍。
　　3.2LL-37合成肽以連續(xù)濃度梯度和時間梯度刺激NCI-H292細胞，收集培養(yǎng)液上清和細胞裂解物，用ELISA分別檢測其中粘蛋白MUC5AC含量，同時BCA法檢測細胞裂解物中總蛋白含量。粘蛋白MUC5AC總量計算公式為:（上清中MUC5AC含量十細胞裂解物中MUC5AC含量）/細胞總蛋白含量。為比對LL-37作用的特異性，

13、亂碼LL-37（scrambleLL-37，sLL-37）合成肽以相同的作用模式刺激細胞，檢測粘蛋白MUC5AC生成的總量。
　　3.3在培養(yǎng)體系中有CSE（0.005cig/ml）存在的情況下，LL-37合成肽和sLL-37合成肽分別以連續(xù)濃度梯度和時間梯度刺激NCI-H292細胞，ELISA檢測細胞粘蛋白MUC5AC生成的總量。
　　3.4在培養(yǎng)體系中有和無CSE(0.005cig/ml)存在的情況下，LL-37合成肽以

14、連續(xù)濃度梯度和時間梯度刺激NCI-H292細胞，ELISA檢測培養(yǎng)上清中IL-8的水平;以重組人IL-8單獨刺激NCI-H292細胞，或經IL-8中和抗體預處理細胞后再給予LL-37合成肽刺激，ELISA檢測粘蛋白MUC5AC生成的總量。
　　3.4CSE以不同作用濃度刺激NCI-H292細胞，免疫熒光染色后激光共聚焦掃描檢測LL-37在細胞中的表達范圍和強度，同時ELISA檢測上清液中LL-37的含量。
　　3.5LL-3

15、7合成肽以連續(xù)濃度梯度和時間梯度刺激NCI-H292細胞，收集上清和細胞裂解物，ELISA檢測上清中TGF-α的含量，Westernblotting檢測細胞裂解物中ERK、EGFR的磷酸化水平，熒光共振能量轉移法（fluorescence resonance energy transfer，FRET）檢測細胞的TACE活性。
　　3.6用TACE抑制劑TAPI-1，EGFR酪氨酸激酶抑制劑AG1478，ERK上游MEK分子的抑制劑

16、U0126，以及TGF-α中和抗體、EGFR中和抗體、AR中和抗體和HB-EGF中和抗體等預處理NCI-H292細胞后，再給予LL-37合成肽刺激，檢測步驟3.5中相應的指標。
　　3.7LL-37合成肽刺激NCI-H292細胞后，利用熒光探針DCF-DA檢測胞內活性氧(ROS)水平;用抗氧化劑DMTU和nPG預處理NCI-H292細胞后再給予LL-37合成肽刺激，FRET檢測細胞TACE活性，ELISA檢測粘蛋白MUC5AC總的

17、生成量。
　　3.8用蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)抑制劑Staurosporine預處理NCI-H292細胞后再給予LL-37合成肽刺激，FRET檢測細胞TACE活性，ELISA檢測粘蛋白MUC5AC生成的總量。
　　結果：
　　1.一般資料比較
　　3組研究對象在年齡和性別比例上無顯著性差異（均P＞0.05），COPD組的FEV1％較肺功能正常吸煙組和肺功能正常不吸煙組明顯降低（均P＜0.

18、05），肺功能正常吸煙組和COPD組的吸煙史（吸煙指數）無顯著性差異(P＞0.05)。
　　2.人體組織病理學研究
　　HE染色結果顯示，COPD組小氣道局部炎癥征象比較明顯，上皮完整性破壞;肺功能正常不吸煙組小氣道無明顯炎癥征象，上皮保持完整;肺功能正常吸煙組小氣道的形態(tài)特征介于前兩組之間。
　　糖原PAS染色結果顯示，COPD組小氣道上皮染色非常明顯，杯狀細胞數明顯增多;肺功能正常不吸煙組小氣道上皮未見明顯染色，杯

19、狀細胞數很少;肺功能正常吸煙組小氣道上皮也有較明顯染色，杯狀細胞數增多，但少于COPD組。PAS染色面積百分比在COPD組最高，肺功能正常不吸煙組最低，肺功能正常吸煙組介于前兩組之間(均P＜0.05)。
　　免疫組化染色結果顯示，LL-37和MUC5AC的著色部位主要位于COPD患者外周小氣道上皮內，其中LL-37分布廣泛，位于纖毛細胞、杯狀細胞等多種細胞內，而粘蛋白MUC5AC分布較單一，主要位于杯狀細胞內。LL-37和粘蛋白M

20、UC5AC染色強度的變化趨勢相似，都是在COPD組最高，肺功能正常不吸煙組最低，肺功能正常吸煙組介于兩組之間(均P＜0.05)。
　　相關性分析表明，小氣道上皮中LL-37和粘蛋白MUC5AC的表達均與肺功能指標FEV1％呈顯著負相關（分別有r=-0.606，P＜0.01;r=-0.641，P＜0.01），而LL-37與粘蛋白MUC5AC呈顯著正相關（r=0.776，P＜0.01）。
　　3.體外研究
　　3.1.細胞

21、活力的MTT檢測結果顯示，LL-37合成肽在0-10μg/ml的濃度范圍內刺激細胞24h，NCI-H292細胞活力不低于80％;CSE在0-0.015cig/ml的濃度范圍內刺激細胞24h，NCI-H292細胞活力不低于80％。
　　3.2.LL-37合成肽單獨刺激NCI-H292細胞可誘導粘蛋白MUC5AC的生成，并呈明顯的濃度-效應和時間-效應關系（均P＜0.05）;在CSE(0.005cig/ml)存在的情況下，LL-37合

22、成肽能以同樣的作用模式誘導粘蛋白MUC5AC的生成，且誘導效應較LL-37合成肽單獨刺激時更強（均P＜0.05）。sLL-37合成肽對NCI-H292細胞粘蛋白MUC5AC的生成無明顯影響(P＞0.05)。
　　3.3.LL-37合成肽單獨刺激NCI-H292細胞可誘導NCI-H292細胞釋放IL-8，并呈明顯的濃度-效應和時間-效應關系（均P＜0.05）;在CSE(0.005cig/ml)存在的情況下，LL-37合成肽能以同樣的

23、作用模式誘導IL-8的釋放，且誘導效應較LL-37合成肽單獨刺激時更強（均P＜0.05）;重組人IL-8可刺激NCI-H292細胞生成粘蛋白MUC5AC，而IL-8中和抗體預處理細胞可顯著抑制LL-37合成肽誘導的粘蛋白MUC5AC生成（均P＜0.05）。
　　3.4.CSE刺激可誘導氣道上皮NCI-H292細胞LL-37表達上調。激光共聚焦掃描圖像顯示，經CSE刺激后細胞中LL-37呈強陽性表達;ELISA結果顯示，經CSE刺激

24、后培養(yǎng)液上清中LL-37含量也明顯增加，且這種增加依賴于CSE的刺激濃度（均P＜0.05）。
　　3.5.LL-37合成肽可誘導ERK和EGFR磷酸化。當刺激時間為15min時，ERK的磷酸化達到峰值水平，在這一時間點，LL-37對ERK和EGFR磷酸化的誘導呈明顯的劑量-效應關系。EGFR酪氨酸激酶抑制劑AG1478可抑制LL-37合成肽誘導的EGFR、ERK磷酸化以及粘蛋白MUC5AC的生成（均P＜0.05）;EGFR中和抗體

25、(Ab-3)和ERK抑制劑U0126可抑制LL-37合成肽誘導的ERK磷酸化以及粘蛋白MUC5AC的生成（均P＜0.05）;AR中和抗體和HB-EGF中和抗體對LL-37合成肽誘導的EGFR磷酸化以及粘蛋白MUC5AC的生成無明顯影響（均P＞0.05）。
　　3.6.LL-37合成肽可濃度和時間依賴性地誘導NCI-H292細胞TACE活化，酶活性的非線性擬合結果表明，細胞TACE活性在刺激6h時達到峰值(P＜0.05)，其后直至2

26、4h，大致保持穩(wěn)定（均P＞0.05）。在刺激粘蛋白MUC5AC生成的同時，LL-37合成肽還能同步誘導氣道上皮細胞產生TGF-α，且也呈明顯的濃度-效應和時間-效應關系（均P＜0.05）。TACE選擇性抑制劑TAPI-1可抑制LL-37合成肽誘導的TGF-α釋放、EGFR磷酸化、ERK磷酸化以及粘蛋白MUC5AC的產生（均P＜0.05）;TGF-α中和抗體和EGFR中和抗體可抑制LL-37合成肽誘導的EGFR磷酸化、ERK磷酸化以及粘蛋

27、白MUC5AC的產生（均P＜0.05）;EGFR中和抗體可增加LL-37誘導的TGF-α水平(P＜0.05)。
　　3.7.LL-37合成肽對NCI-H292細胞內ROS水平無明顯影響(P＞0.05);抗氧化劑DMTU和nPG對LL-37合成肽誘導的TACE活化和粘蛋白MUC5AC的生成無明顯影響（均P＞0.05）;PKC抑制劑Stauropsorine對LL-37合成肽誘導的TACE活化和粘蛋白MUC5AC的生成也無明顯影響（均

28、P＞0.05）。
　　結論：
　　1.COPD患者外周小氣道上皮中Cathelicidin/LL-37和粘蛋白MUC5AC均呈高表達狀態(tài)，且二者密切相關;
　　2.Cathelicidin/LL-37可誘導人氣道上皮細胞粘蛋白MUC5AC的產生，在香煙煙霧作用下，這種誘導效應更強;
　　3.Cathelicidin/LL-37誘導粘蛋白MUC5AC生成的機制可能涉及TACE-TGF-α-EGFR-ERK信號通路的