1、隨著人們生活方式的改變，糖尿病在全世界廣泛分布，做為一種基礎(chǔ)疾病，其發(fā)病率增高，并發(fā)癥常見，病程難以控制，給人們生活、學(xué)習(xí)、經(jīng)濟造成嚴(yán)重負(fù)擔(dān)。經(jīng)中醫(yī)臨床實踐的檢驗，已發(fā)現(xiàn)中藥控制糖尿病有可喜的療效。復(fù)方升清降糖合劑是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，經(jīng)實踐檢驗的有效降糖湯方，臨床觀察結(jié)果還發(fā)現(xiàn)對改善全身狀況，提升生活質(zhì)量有很大裨益。為進一步明確其作用機制，我們從保護胰島細胞角度入手，了解其抗細胞凋亡的作用，同時探討其對胰島素信號通路和凋亡通路的影響，尋

2、找其藥物作用的靶點，為臨床用藥和糖尿病的治療提供新思路。 目的： (1)觀察升清降糖合劑(SQ)對氧化損傷胰島β細胞模型活性的影響； (2)探討升清降糖合劑對細胞SOD/MDA、Bcl-2/Bax、Caspase-3的影響，揭示其抗氧化和抗凋亡作用機制； (3)研究SQ對Akt磷酸化的影響，尋找SQ抗胰島細胞凋亡和調(diào)節(jié)胰島素的共同信號通路。 方法： (1)稱取原方比例升清降糖合劑(SQ)，

3、研末，過篩，以半仿生提取法設(shè)計提取條件，常壓恒溫提取，合并兩次煎液，冷凍干燥，計干浸膏總量； (2)利用不同濃度和時間H2O2誘導(dǎo)大鼠胰島細胞瘤株(RINm5F)損傷，MTT檢測細胞增殖率，以達到IC50做為氧化損傷凋亡模型條件，AO/PI熒光染色觀察模型形態(tài)學(xué)改變，確定凋亡模型的成功； (3)以D-PBS配成不同濃度SQ，干預(yù)模型組24h后，以MTT檢測細胞增殖率，倒置顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察，確定SQ的最佳保護劑量；

4、 (4)分模型組(H2O2)、保護組(SQ+H2O2)、正常組(D-PBS)，分別干預(yù)24 h，運用流式細胞儀檢測凋亡率；光度法檢測SOD/MDA、Caspase-3，免疫熒光檢測Bcl-2/Bax蛋白，免疫印跡檢測Akt磷酸化表達。 結(jié)果： (1)SQ的提取：以半仿生提取法提取復(fù)方有效成分，得干浸膏凍干品3.0 g。 (2)胰島β細胞氧化損傷模型的建立：MTT法檢測顯示RINm5F增殖率隨H2O2干預(yù)濃度的增長

5、而減少，呈直線負(fù)相關(guān)，P<0.01，我們確定IC50即0.2 mmol·L-1H2O2干預(yù)24 h為模型條件，AO/PI形態(tài)學(xué)觀察，模型組呈典型凋亡改變：細胞皺縮，核邊聚，可見凋亡小泡。 (3)SQ最佳保護濃度的確立：MTT法檢測不同濃度SQ加入模型組24h的細胞增殖率，其中10μg·ml-1 SQ組較模型組活性明顯升高，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)較模型組明顯好轉(zhuǎn)；而不同濃度SQ對照組(即SQ加入正常

6、組)與正常組比較，高濃度SQ對照組(50μg·ml-1)細胞活性有所下降(P>0.05)，低濃度SQ對照組(5μg·ml-1)及中濃度SQ對照組(10μg·ml-1)對細胞活性影響不大(P>0.05)，故以10μg·ml-1 SQ組為保護治療劑量。 (4)細胞凋亡率：流式細胞術(shù)檢測凋亡率提示模型組(35.18±2.41％)增高，與正常組(17.38±0.91％)比較，差異顯著(P<0.001)，與保護組(19.56±1.08％)

7、有顯著差異(P<0.01)。 (5)SOD/MDA水平： 1)細胞內(nèi)：模型組SOD水平(25.36±2.94 U·ml-1)下降，與保護組(34.13±4.81U·ml-1)比較，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，模型組SOD/MDA比值(14.45±2.83)下降，與保護組(24.43±4.89)比較，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)； 2)細胞外：模型組MDA水平(20.50±12.50 nmol·L-1)上升，與正

8、常組(15.13±2.69 nmol·L-1)比較，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，與保護組(18.80±1.48 nmol·L-1)比較，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，模型組SOD/MDA比值(0.90±10.26)下降，與正常組(1.60±0.53)比較，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。 (6)Bcl-2/Bax熒光表達： Bcl-2：模型組(0.07±0.00)熒光減弱，與正常組(0.06±0.02)比較，統(tǒng)計學(xué)無差

9、異(P>0.05)，與保護組(0.16±0.02)比較，統(tǒng)計學(xué)有差異(P<0.05)；Bax：模型組(0.09±0.01)熒光加強，與正常組(0.05±0.01)比較，統(tǒng)計學(xué)有差異(P<0.05)，與保護組(0.07±0.01)比較，統(tǒng)計學(xué)有差異(P<0.05)。 (7)Caspase-3活化程度檢測： RINm5F：模型組(2.87±0.49)增強，與正常組(1.00±0.00)比較，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，與

10、保護組(2.24±0.46)比較，無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；原代胰島：模型組(1.97±0.26)增強，與正常組(1.00±0.00)比較，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，與保護組(1.29±0.21)比較，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。 (8)磷酸化Akt蛋白表達： RINm5F：模型組(0.47±0.03)降低，與正常組(0.65±0.05)比較，統(tǒng)計學(xué)有差異(P<0.05)，與保護組(0.85±0.05)比較，

11、統(tǒng)計學(xué)有顯著差異(P<0.01)；原代胰島：模型組(0.43±0.06)降低，與正常組(0.62±0.06)比較，統(tǒng)計學(xué)有差異(P<0.05)，與保護組(0.66±0.06)比較，統(tǒng)計學(xué)有差異(P<0.05)。 結(jié)論： (1)半仿生提取法保持了中醫(yī)復(fù)方的有效成分，具有良好的穩(wěn)定性和，可重復(fù)性強，值得進一步工藝研究； (2)一定濃度的H2O2導(dǎo)致胰島β細胞慢性氧化損傷，誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，通過凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/B

12、ax和Caspase-3激活凋亡級聯(lián)反應(yīng)，其調(diào)節(jié)可能與Akt失活導(dǎo)致的信號通路受抑有關(guān)； (3)一定劑量SQ可保護慢性氧化應(yīng)激狀態(tài)下胰島β細胞的活性，SQ具有抗氧化酶活性，抵制脂質(zhì)過氧化損傷，阻止其凋亡的發(fā)生和發(fā)展，參與凋亡早期的調(diào)節(jié)，通過凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax和Caspase-3抑制凋亡的發(fā)展； (4)SQ對磷酸化Akt有著重要的調(diào)節(jié)作用，SQ參與調(diào)節(jié)PI3K-Akt通路，達到抗氧化、抗胰島細胞凋亡。