1、一、研究背景: 系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一個累及多個系統(tǒng)的自身免疫性結締組織疾病。臨床表現(xiàn)多種多樣，致殘致死率高。目前主要依賴藥物治療，缺乏副作用小、長期有效的治療手段。因此非常有必要進一步探索疾病發(fā)生機理和尋求新的治療方法。 骨髓間充質干細胞(BM—MSCs)是骨髓來源的不同于造血干細胞的另一種多能干細胞。該細胞具有多分化潛能，可以分化為多個胚層的細胞；具有低免疫原性，不會刺激同種異體淋巴細胞增殖；具有強的免疫調節(jié)作

2、用，可以抑制多種免疫細胞的增殖和活化，包括T、B淋巴細胞、樹突狀細胞、自然殺傷細胞。MSCs主要通過可溶性的細胞因子發(fā)揮免疫調節(jié)作用，轉化生長因子β1(TGF—β1)是其中一個非常重要的因子。 BM—MSCs在移植耐受、胎兒胎盤免疫耐受、自身免疫中有非常重要的免疫調節(jié)作用和現(xiàn)實意義。體外實驗、動物實驗和人體實驗顯示，MSCs可以抑制SLE異常的免疫反應，改善疾病癥狀，安全性高，副作用小。同種異體BM—MSCs移植治療SLE患者

3、具備理論基礎和得到實踐檢驗。但是，BM—MSCs移植治療SLE患者的時機和細胞輸入量仍未確定。BM—MSCs的免疫調節(jié)作用是劑量依賴的且具有雙向性，正確的輸入量非常重要。SLE患者體內存在許多異常因素如細胞因子異常和免疫細胞紊亂。這些異常因素是否影響MSCs的存活和免疫功能的發(fā)揮，未見相關文獻報道。因此，非常有必要進一步研究機體內環(huán)境(主要是外周血)對MSCs增殖和免疫調節(jié)功能的影響，為確定輸入MSCs的最佳時機和調整輸入MSCs的數量

4、提供參考依據。 二、研究目的: 本次試驗擬通過研究處于不同疾病狀態(tài)(穩(wěn)定期、活動期)的SLE患者的血清對正常人骨髓MSCs增殖的影響，以及處于不同疾病狀態(tài)(穩(wěn)定期、活動期)的SLE患者外周血單個核細胞對正常人BM—MSCs增殖和分泌TGF—β1的影響，為選擇什么時機輸入MSCs，應該輸入多少MSCs提供初步的理論依據。 三、研究方法: 1、Ficoll梯度密度離心法聯(lián)合羥乙基淀粉自然沉淀法分離健康志愿者骨

5、髓間充質干細胞。體外培養(yǎng)、擴增。流式細胞儀鑒定細胞表面分子CD29、CD44、CD34、CD45、CD105、HLA—DR。流式細胞儀檢測細胞凋亡。CCK—8法繪制骨髓MSCs生長曲線。 2、制備含不同濃度(5％、10％、15％、20％)健康志愿者、SLE患者活動期、穩(wěn)定期血清的低糖DMEM(LG—DMEM)培養(yǎng)基。培養(yǎng)MSCs三天后CCK—8法檢測各組MSCs的增殖情況。ELISA檢測各組血清中TGF—β1的水平。 3

6、、分離健康志愿者、活動期SLE患者、穩(wěn)定期SLE患者PBMC，按不同比例(PBMC/MSC0.1：1、1：1、10：1、100：1、500：1)與健康志愿者骨髓MSCs混合培養(yǎng)。三天后CCK—8法分別檢測各組PBMC和MSCs的增殖情況。ELISA檢測培養(yǎng)上清TGF—β1的水平。 4、統(tǒng)計方法：試驗結果以均數士標準差(X±s)表示。利用SAS8.1統(tǒng)計軟件包分析實驗數據。同組內各濃度(比例)間差異采用隨機區(qū)組設計資料的方差分析，

7、同一濃度(比例)不同組間差異采用單因素方差分析，兩兩比較采用多組均數問的多重比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 四、結果: 1、利用Ficoll梯度密度離心法聯(lián)合羥乙基淀粉自然沉淀法成功分離健康志愿者骨髓MSCs。流式細胞儀鑒定表面分子顯示，MSCs高表達CD29、CD44、CD105，低表達或不表達CD34、CD45、HLA—DR，第3代BM—MSCs純度達到了99％。凋亡細胞率為2.03％。細胞生長狀況良好。

8、 2、健康對照組各血清濃度(5％、10％、15％、20％)培養(yǎng)BM—MSCs三天后吸光度值分別為0.194±0.017、0.238±0.035、0.289±0.015、0.407±0.022；SLE穩(wěn)定期組分別為0.16±0.015、0.196±0.012、0.199±0.023、0.310±0.016；SLE活動期組分別為0.111±0.016、0.138±0.014、0.199±0.022、0.199±0.023。健康對照組內各

9、血清濃度間吸光度值比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，SLE患者穩(wěn)定期組內各血清濃度間吸光度值比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，活動期組內各血清濃度間吸光度值比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。SLE穩(wěn)定期組、活動期組的各血清濃度組與健康對照組相應血清濃度組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 3、健康對照組、SLE活動期患者和穩(wěn)定期患者PBMC與同種異體BM—MSCs細胞按不同比例(PBMC/MSC：500：1、10

10、0：1、10：1、1：1、0.1：1)混合培養(yǎng)，結果顯示，當PBMC/MSC比值較高時(500：1、100：1) BM—MSCs增殖受到抑制(與空白對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義P<0.05)，SLE活動期和穩(wěn)定期PBMC抑制BM—MSCs增殖(與健康對照組比較差異有統(tǒng)計學意義P<0.05)。三組內部不同比例間相互比較顯示，隨著PBMC/MSC比值的增加，BM—MSCs增殖受到的抑制增強(不同比例組間比較差異具有統(tǒng)計學意義P<0.05)。

11、 4、健康對照組、SLE活動期患者和穩(wěn)定期患者PBMC與健康志愿者BM—MSCs細胞按不同比例(PBMC/MSC：500：1、100：1、10：1、1：1、0.1：1)混合培養(yǎng)，結果顯示，當PBMC/ MSC比值較低時(0.1：1、1：1、10：1)，各組PBMC的增殖率低于空白對照組(P<0.05)。隨著PBMC/ MSC比值逐漸增大，健康對照組、SLE活動期患者和穩(wěn)定期患者PBMC的存活率逐漸增大(組內各個比例間差異具有統(tǒng)計

12、學意義P<0.05)，抑制率逐漸降低(組內各個比例間差異具有統(tǒng)計學意義P<0.05)。當PBMC/ MSC比值為10：1和100：1時，SLE活動期和穩(wěn)定期患者PBMC存活率高于健康對照組(P<0.05)，抑制率低于健康對照組(P<0.05)。 5、ELISA檢測各組血清中TGF—β1的含量，結果顯示健康對照組406.79±48.3(pg/ml)，SLE穩(wěn)定期患者血清375.22±52.6(pg/ml)，SLE活動期患者血清33

13、5.12±60.37(pg/ml)。三組間TGF—β1水平差異具有統(tǒng)計學意義，健康對照組高于SLE患者，SLE穩(wěn)定期血清TGF—β1高于活動期(P<0.05)。 6、PBMC/MSC比例為0.1：1、1：1、10：1時，BM—MSCs分泌TGF—β1水平高于空白對照組水平，比例為100：1、500：1時低于空白對照(各組與空白對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義，P<0.05)。 五、結論: 1、SLE患者血清抑制骨髓M

14、SCs增殖，可能與血清TGF—β1水平降低有關。 2、外周血單個核細胞與骨髓MSCs存在相互抑制，抑制的方向取決于兩者的比例。當PBMC/MSC比值≤10：1時，健康志愿者BM—MSCs抑制SLE患者PBMC增殖，隨著PBMC/MSC比值增大抑制減弱，且與SLE患者的疾病活動程度相關。當PBMC/MSC比值≥100：1，SLE患者PBMC抑制健康志愿者BM—MSCs增殖，隨著PBMC/MSC比值增大抑制增強，且與SLE患者的疾病