1、目的：建立近端腎小管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定方法、建立共培養(yǎng)體系，體外觀察近端腎小管上皮細(xì)胞lQ羥化酶表達(dá)的調(diào)節(jié)及對(duì)成骨細(xì)胞的影響，為篩選增強(qiáng)1Q羥化酶活性、改善骨代謝的藥物打下試驗(yàn)基礎(chǔ)；研究射線對(duì)1α羥化酶表達(dá)調(diào)節(jié)的同時(shí)觀察射線對(duì)近端‘腎小管上皮細(xì)胞的亞顯微結(jié)構(gòu)的損傷，擬闡述輻射性腎性骨營(yíng)養(yǎng)不良的發(fā)病機(jī)制。 方法：①采用篩網(wǎng)分離法進(jìn)行近端腎小管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并利用透射、掃描電鏡及細(xì)胞化學(xué)

2、染色法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行初步鑒定。②培養(yǎng)的近端腎小管上皮細(xì)胞與25(0H)D3體外孵育，采用高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)孵育后細(xì)胞及其上清液的脂質(zhì)抽提產(chǎn)物，對(duì)體外培養(yǎng)的近端腎小管上皮細(xì)胞進(jìn)行活性維生素D合成功能的鑒定。③采用137Cs—Y射線，分別對(duì)培養(yǎng)近端。腎小管上皮細(xì)胞進(jìn)行0Gy、3Gy、5Gy、10Gy不同劑量的單次照射，照射后24h，采用透射電鏡及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-timeQ-PCR)技術(shù)，觀察細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)及胞內(nèi)1α羥化

3、酶mRNA表達(dá)水平的變化及與電離輻射的劑量．效應(yīng)關(guān)系。④觀察并比較PTH、lα，25(0H)2D3對(duì)正常和輻射損傷后的近端腎小管上皮細(xì)胞1α羥化酶表達(dá)水平的調(diào)節(jié)作用。⑤利用Trans-Well六孔共培養(yǎng)板，建立近端腎小管上皮細(xì)胞與成骨細(xì)胞的共培養(yǎng)體系，觀察近端腎小管上皮細(xì)胞對(duì)成骨細(xì)胞內(nèi)成骨特異基因ALP、BGP、COLI及破骨分化相關(guān)基因RANKL、OPG表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。 結(jié)果：①體外培養(yǎng)的近端腎小管上皮細(xì)胞呈典型上皮樣，核大而

4、圓，核仁明顯，細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，6—7天即達(dá)匯合。電鏡觀察顯示培養(yǎng)細(xì)胞以基底側(cè)附于瓶底，細(xì)胞之間緊密聯(lián)結(jié)，面向液層的刷狀緣有豐富微絨毛，胞內(nèi)有豐富的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、吞飲小泡，堿性磷酸酶染色陽(yáng)性，這些均表明培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)源于近端腎小管上皮。②體外培養(yǎng)的近端腎小管上皮細(xì)胞與25(OH)D3進(jìn)行孵育后，抽提產(chǎn)物中檢測(cè)到有1α，25(0H)2D3的生成。④體外培養(yǎng)的近端。腎小管上皮細(xì)胞接受PTH及l(fā)Q，25(0H)2D3刺激24h后，與對(duì)照組相比，1Q

5、羥化酶的表達(dá)水平分別被上調(diào)30．8％(P<0．05)，下調(diào)40．9％(P<0．01)。④1377Cs-γ射線照射細(xì)胞24h后，細(xì)胞形態(tài)特別是線粒體形態(tài)損傷明顯，細(xì)胞1α羥化酶mRNA表達(dá)水平下降，且隨照射劑量增加下降幅度增大，與0Gy組相比，3Gy、5Gy、10Gy組1Q羥化酶表達(dá)下降幅度分別達(dá)32．9％，42．4％，66．1％(P<0．01)。⑤輻射損傷后的近端腎小管上皮細(xì)胞受PTH及1Q，25(0H)2D3調(diào)節(jié)時(shí)，1Q羥化酶表達(dá)的調(diào)

6、節(jié)幅度變小，分別僅有¨．9％增幅，18．3％(P

7、著上調(diào)；而使用射線照射近端。腎小管上皮細(xì)胞，抑制1Q羥化酶表達(dá)，減少1Q，25(0H)2D3合成時(shí)，共培養(yǎng)體系中成骨細(xì)胞內(nèi)成骨特異基因ALP、BGP、COLI及破骨分化相關(guān)基因RANKL、OPG的表達(dá)水平則更低。 結(jié)論：①篩網(wǎng)分離法可獲得足量、純度大于00％的近端腎小管上皮細(xì)胞，形態(tài)及細(xì)胞化學(xué)鑒定基礎(chǔ)上對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行功能鑒定，對(duì)使用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行體外相關(guān)功能研究至關(guān)重要。②體外培養(yǎng)的近端腎小管上皮1Q羥化酶活性正常，可合成1Q

8、，25(0H)2D3，并且其1α羥化酶基因的表達(dá)受PTH及1α，25(0H)2D3的良好調(diào)節(jié)。③近端腎小管上皮細(xì)胞對(duì)射線敏感，電離輻射可致細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)尤其線粒體的損傷，1α羥化酶表達(dá)水平下降，并且導(dǎo)致PTH及1Q，25(0H)2D3對(duì)細(xì)胞1α羥化酶表達(dá)的正常調(diào)節(jié)作用減弱，表明照射后的腎小管上皮細(xì)胞的反應(yīng)性減弱，這可能是輻射性腎性骨病發(fā)生的機(jī)制之一。④近端腎小管上皮細(xì)胞是執(zhí)行腎臟對(duì)骨的調(diào)節(jié)作用的重要功能細(xì)胞。其合成的1Q，25(OH)2