1、菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat.），原產(chǎn)中國(guó)，是中國(guó)十大名花之一，同時(shí)它也是世界四大切花之首，占全球切花數(shù)量的30％。菊花腦（Chrysanthemumnankingense）為栽培菊花起源中參與起源且遺傳背景最為簡(jiǎn)單的二倍體菊屬野生植物。在對(duì)栽培菊花進(jìn)行分子遺傳學(xué)和分子生物學(xué)分析時(shí)，其簡(jiǎn)單的遺傳背景為解決因菊花較高染色體數(shù)而遇到的難題提供了極好的模式作用。轉(zhuǎn)基因技術(shù)成為進(jìn)行作物品種改良和基因功能研究

2、的重要手段。菊花是基因工程起步較晚的觀賞植物，轉(zhuǎn)化過(guò)程受載體和啟動(dòng)子類型等的影響，成功轉(zhuǎn)化并能穩(wěn)定表達(dá)的研究報(bào)道較少。菊花遺傳轉(zhuǎn)化效率低及轉(zhuǎn)化的基因并沒(méi)有得到預(yù)期表達(dá)是菊花基因工程研究中亟待解決的問(wèn)題之一。研究轉(zhuǎn)化方法和啟動(dòng)子對(duì)菊花轉(zhuǎn)基因的影響有利于解決這一問(wèn)題。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1.35S:GUS、2×35S:GUS超表達(dá)菊花的獲得及表達(dá)分析
　　通過(guò)設(shè)計(jì)引物，利用PCR等技術(shù)從pCAMBIA1301 V

3、ector中克隆了35S啟動(dòng)子、2×35S啟動(dòng)子的序列。將35S啟動(dòng)子和2×35S啟動(dòng)子序列分別插入pORE R1 Vector、pORE R2 Vector中，分別獲得了重組載體pORE R1-35S:GUS、pORE R2-35S:GUS、pORE R1-2×35S:GUS、pORE R2-2×35S:GUS，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將構(gòu)建的菊花遺傳轉(zhuǎn)化載體分別導(dǎo)入切花菊品種‘神馬’中。共轉(zhuǎn)化4090個(gè)菊花葉盤，經(jīng)過(guò)篩選共得到22個(gè)高表達(dá)轉(zhuǎn)

4、基因株系。22個(gè)轉(zhuǎn)基因株系經(jīng)PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)目標(biāo)片段已經(jīng)成功插入菊花基因組。GUS熒光定量PCR顯示:在同一類型的載體中，2×35S比35S啟動(dòng)子表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)性，可獲得高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系，前者的GUS表達(dá)量約為后者的2倍，GUS化學(xué)染色也較深。
　　2.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的菊花葉片瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建
　　本研究以GUS作為報(bào)告基因，通過(guò)農(nóng)桿菌注射滲透法將含有GUS基因的表達(dá)載體pORE R1-2×35S:GUS轉(zhuǎn)入菊花腦、菊花‘神

5、馬’和‘優(yōu)香’葉片，探討了基因型、葉片位置等因素對(duì)基因瞬時(shí)表達(dá)效果的影響。結(jié)果表明:菊花品種‘優(yōu)香’的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化率最高，為76.67％，表達(dá)效率也最佳;菊花腦的轉(zhuǎn)化率最低，為60.0％，表達(dá)效率較差，部分葉片枯死;瞬時(shí)轉(zhuǎn)化注射葉片選擇第4片全部展開(kāi)葉為宜。為了便于其它基因的操作，把GUS基因重組到Gateway載體pMDC43（2×35S），進(jìn)一步驗(yàn)證了其在上述種源中的瞬時(shí)表達(dá)有效性。該體系的建立為在菊花葉片中基因功能的分析提供了有效手段