1、背景:
　　非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholicfattyliverdisease,NAFLD)是一種組織學(xué)上表現(xiàn)為肝臟脂肪變性的臨床病理綜合征,但應(yīng)排除酒精性、感染性、藥物性和先天性代謝異常等繼發(fā)因素,其疾病譜包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholicsteatohepatitis,NASH)及其進(jìn)展而來的肝硬化和肝癌[1]。目前觀點(diǎn)認(rèn)為,單純性脂肪肝屬于良性病變,而NASH則可以進(jìn)展至肝臟纖維化、肝

2、硬化和肝癌[2],但是NASH的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明。胰島素抵抗在NASH患者中普遍存在,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)肝臟胰島素抵抗可以先于外周胰島素抵抗出現(xiàn)[3],因此,延緩或阻止肝臟胰島素抵抗的發(fā)生和進(jìn)展,則有可能成為治療NASH的重要靶點(diǎn)。但是目前有關(guān)肝臟胰島素抵抗的確切發(fā)病機(jī)制,仍有待于進(jìn)一步研究。
　　肝臟胰島素作用主要是通過IR/IRS/PI3K/Akt信號通路發(fā)揮作用。正常情況下,胰島素可以通過抑制糖原異生和肝臟糖原分解,從而調(diào)節(jié)

3、肝臟糖原輸出,而在肝臟胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下,此種抑制作用受損導(dǎo)致高血糖和代償性高胰島素血癥[4]。大量研究證實(shí),氧化應(yīng)激是高脂飲食誘導(dǎo)肝臟胰島素抵抗發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制。脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物和氧化應(yīng)激導(dǎo)致的DNA損傷產(chǎn)物,如4HNE和8羥基脫氧鳥苷,與胰島素抵抗嚴(yán)重程度呈現(xiàn)正相關(guān)[5]。另外,有證據(jù)提示脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物還可以激活炎癥信號通路IKK/NF-κB并促進(jìn)炎癥因子TNFα和IL-6等的釋放,間接誘導(dǎo)胰島素抵抗。和健康人群相比,NASH患者ROS表

4、達(dá)和炎癥因子水平都明顯增加[6]。事實(shí)上,脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物和炎癥因子具有協(xié)同作用,它們可以通過促使胰島素信號通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化而觸發(fā)胰島素抵抗的發(fā)生。
　　轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(NF-E2-relatedfactor2,Nrf2)是細(xì)胞防御氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子,它可以與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant-responseelement,ARE)結(jié)合,上調(diào)抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表達(dá),增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力[7]。最

5、近研究認(rèn)為Nrf2是細(xì)胞抗氧化反應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)者,Nrf2能夠維持細(xì)胞內(nèi)的氧化平衡,降低細(xì)胞對死亡信號的敏感性,在細(xì)胞抵御外源性或內(nèi)源性的氧化應(yīng)激的機(jī)制中起重要作用[8]。但目前關(guān)于Nrf2在肝臟胰島素抵抗中的作用仍然不是很清楚。
　　因此本研究利用Nrf2基因敲除小鼠,通過高脂飲食誘導(dǎo)肝臟胰島素抵抗,探討其發(fā)生的相關(guān)具體機(jī)制。
　　目的:
　　本實(shí)驗(yàn)采用高脂飲食制備小鼠肝臟胰島素抵抗動物模型,觀察氧化應(yīng)激對肝臟細(xì)胞轉(zhuǎn)錄

6、因子Nrf2核轉(zhuǎn)位的影響,研究敲除Nrf2對肝臟胰島素信號通路(IRS/Akt)和炎癥信號通路(IKK/NF-κB)的影響,為以Nrf2為靶點(diǎn)進(jìn)行肝臟胰島素抵抗的防治提供新的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　方法:
　　1、Nrf2基因敲除(Nrf2-null)和野生型(WT)ICR雄性小鼠各10只,隨機(jī)分為WT組(n=5)、WT高脂飲食組(WT+HFD)(n=5)、Nrf2-null組(n=5)和Nrf2-null高脂飲食組(Nr

7、f2-null+HFD)(n=5),喂養(yǎng)8周,每周記錄體重變化,8周末,空腹12h,腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后,稱取肝臟重量;生化法檢測肝臟甘油三酯(triglyceride,TG)含量;分光光度法檢測肝臟丙二醛(malondialdehyde,MDA)和谷胱甘肽水平(glutathione,GSH);Western-blot法檢測肝臟Nrf2、Nqo1等的表達(dá)變化;肝臟組織HE染色觀察肝臟病理學(xué)改變。
　　2、Nrf2基因敲除(N

8、rf2-null)和野生型(WT)ICR雄性小鼠各10只,隨機(jī)分為WT組(n=5)、WT高脂飲食組(WT+HFD)(n=5)、Nrf2-null組(n=5)和Nrf2-null高脂飲食組(Nrf2-null+HFD)(n=5),喂養(yǎng)8周,每周記錄體重變化,8周末空腹12h行腹腔注射葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn);生化法檢測空腹血清血糖;分光光度法檢測肝臟丙二醛(malondialdehyde,MDA)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平;E

9、LISA和RT-PCR檢測肝臟TNF-α和IL-6mRNA和蛋白表達(dá);Westernblot法檢測肝臟NF-κB、IRS1、Akt、GSK-3β、FoXO1等表達(dá)的變化。
　　結(jié)果:
　　1.8周末,高脂飲食組小鼠體重顯著高于普通飲食組(P<0.05),且Nrf2-null高脂飲食小鼠體重高于WT高脂飲食小鼠,但二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。生化結(jié)果顯示,高脂飲食組小鼠肝臟重量和肝臟TG含量顯著高于普通飲食組(P<0

10、.05),且Nrf2-null高脂飲食小鼠顯著高于WT高脂飲食小鼠(P<0.05)。肝臟組織學(xué)顯示,和普通飲食組小鼠相比,WT高脂飲食小鼠肝臟組織學(xué)結(jié)構(gòu)紊亂,肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯的脂肪沉積,表現(xiàn)為肝細(xì)胞大皰性脂肪變性;Nrf2-null小鼠肝臟肝細(xì)胞呈現(xiàn)氣球樣變性,伴小葉靜脈周圍及肝細(xì)胞周圍大量炎癥細(xì)胞浸潤。
　　2.8周末,高脂飲食組小鼠肝臟MDA顯著高于普通飲食組小鼠(P<0.05),GSH水平顯著低于高脂飲食組小鼠(P<0.05)

11、,而且Nrf2-null高脂飲食組小鼠肝臟MDA水平顯著高于WT高脂飲食組(P<0.05),GSH水平顯著低于WT高脂飲食組小鼠(P<0.05)。WesternBlot結(jié)果顯示,Nrf2-null組小鼠肝臟無明顯Nrf2總蛋白的表達(dá),WT高脂飲食組小鼠肝臟Nrf2總蛋白表達(dá)和WT普通飲食組未見明顯變化,而WT高脂飲食組小鼠肝臟Nrf2胞核蛋白表達(dá)顯著高于WT普通飲食組;Nqo1表達(dá)在Nrf2-null小鼠中顯著減少,而WT高脂飲食組小鼠

12、肝臟Nqo1表達(dá)顯著高于WT普通飲食組小鼠。
　　3.8周末,高脂飲食組小鼠空腹血糖顯著高于普通飲食組(P<0.05),Nrf2-null高脂飲食組小鼠空腹血糖高于WT高脂飲食組小鼠,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。腹腔注射葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,高脂飲食組小鼠15min、30min、60min血糖和AUC顯著高于普通飲食小鼠(P<0.05),且Nrf2-null高脂飲食組小鼠顯著高于WT高脂飲食組小鼠(P<0.05)。Wes

13、tern-Blot結(jié)果顯示,肝臟總IRS-1和Akt在各組間無明顯差異,WT高脂飲食組小鼠肝臟p-IRS1(Tyr)、p-Akt(Ser307)、p-GSK-3β和p-FoXO1表達(dá)較WT組減少,且Nrf2-null+HFD組p-IRS1(Tyr)、p-Akt(Ser307)、p-GSK-3β和p-FoXO1表達(dá)較WT高脂飲食組顯著減少。
　　4.8周末,ELISA和RT-PCR結(jié)果顯示,高脂飲食組小鼠肝臟TNFα和IL-6顯著高

14、于普通飲食組小鼠,而Nrf2-null高脂飲食組小鼠肝臟TNFα和IL-6水平顯著高于WT高脂飲食組。WesternBlot結(jié)果顯示,NF-κB總蛋白在各組表達(dá)無明顯差異,而WT高脂飲食組小鼠肝臟NF-κB胞核蛋白表達(dá)明顯高于普通飲食組,且Nrf2-null高脂飲食組小鼠肝臟NF-κB胞核蛋白表達(dá)明顯高于WT高脂飲食組。
　　結(jié)論:
　　8周高脂飲食誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)明顯氧化應(yīng)激,證實(shí)在氧化應(yīng)激條件下肝臟轉(zhuǎn)錄因子Nrf2發(fā)生核轉(zhuǎn)位