1、目的:利用曲美他嗪(TMZ)預(yù)處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs),于心肌梗死急性期行血運(yùn)重建聯(lián)合細(xì)胞移植治療,研究其對(duì)心功能改善的影響,并初步探尋其作用的機(jī)制。
　　方法:體外部分:取6-8周齡SD大鼠的脛骨及股骨分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,用全骨髓差異貼壁法培養(yǎng)及純化BMSCs,并取第3代BMSCs用于本實(shí)驗(yàn)。利用1-3天的SD乳鼠心臟在體外分離培養(yǎng)新生大鼠心室肌細(xì)胞(NRVMs),取原代培養(yǎng)第3天的心肌細(xì)胞,分別收集正常和缺氧/復(fù)氧

2、(H/R)處理的心肌細(xì)胞上清液,對(duì)其上清液中乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)的含量進(jìn)行檢測(cè)。將P3代BMSCs分為以下四組:①Control組:BMSCs+正常細(xì)胞培養(yǎng)液;②H/R組:BMSCs+H/R上清液;③TMZ組:TMZ預(yù)處理BMSCs+正常細(xì)胞培養(yǎng)液;④TMZ+H/R組:TMZ預(yù)處理BMSCs+H/R上清液。利用CCK-8法檢測(cè)上述各組BMSCs的細(xì)胞活性,RT-PCR檢測(cè)其細(xì)胞Bcl-2、Ba

3、x的表達(dá)。
　　體內(nèi)部分:細(xì)胞移植前用熒光染料CM-Dil標(biāo)記BMSCs,建立大鼠心肌缺血再灌注(I/R)模型32只,隨機(jī)分為四組:①Sham組:冠脈只穿線不結(jié)扎;②I/R組:結(jié)扎冠狀動(dòng)脈1h后開放阻斷的冠脈(模擬血運(yùn)重建),注射無細(xì)胞的上清液;③BMSCs組:結(jié)扎冠狀動(dòng)脈1h后開放阻斷的冠脈,注射無藥物預(yù)處理干細(xì)胞;④BMSCs+TMZ組:結(jié)扎冠狀動(dòng)脈1h后開放阻斷的冠脈,注射藥物預(yù)處理干細(xì)胞。各組于I/R后3h采集大鼠血清進(jìn)行

4、LDH、MDA及SOD的測(cè)定。術(shù)后1周各組隨機(jī)處死2只大鼠,檢測(cè)其植入體內(nèi)的BMSCs的存活數(shù)量,其余大鼠飼養(yǎng)至移植后4周接受心功能測(cè)定,檢查后處死,其中每組3只用于計(jì)算梗死面積,其余3只取心臟組織用于蛋白提取,Western Blot分析Bcl-2及Bax的表達(dá)。
　　結(jié)果:體外部分:1.與正常對(duì)照組比較,經(jīng)過H/R處理過的心肌細(xì)胞上清液中LDH、MDA活性顯著升高(P<0.05),SOD活性降低(P<0.05)。2.在BMSC

5、s與心肌細(xì)胞上清液共培養(yǎng)各組中,H/R組細(xì)胞活力較Control組顯著下降(P<0.05),但培養(yǎng)前經(jīng)過TMZ預(yù)處理后,該組細(xì)胞的活力較H/R組可顯著提高(P<0.05)。3.RT-PCR結(jié)果表明:H/R組細(xì)胞Bcl-2的基因表達(dá)水平稍有減少,但與正常組相比無差異(P>0.05),但TMZ+H/R組細(xì)胞Bcl-2的基因表達(dá)水平較H/R組相比,前者明顯高于后者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);H/R組細(xì)胞Bax的基因表達(dá)水平稍有增多,可

6、與正常組相比無差異(P>0.05),但TMZ+H/R組細(xì)胞Bax的基因表達(dá)水平較H/R組相比,前者明顯低于后者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　體內(nèi)部分:1.用“二線二結(jié)”法能夠方便、成功地建立大鼠在體心肌缺血再灌注模型。2.與Sham組比較,再灌注后3h其余各組LDH、MDA活性均顯著升高(P<0.05),SOD活性均顯著降低(P<0.05),三組組間兩兩比較無明顯差異(P>0.05)。3.術(shù)后1周,將組織進(jìn)行快速冰凍切

7、片,在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)雙標(biāo)記 BMSCs,發(fā)現(xiàn)BMSCs+TMZ組每個(gè)高倍鏡下雙標(biāo)記細(xì)胞數(shù)顯著高于BMSCs組(P<0.05)。4.術(shù)后4周, BMSCs組和 BMSCs+TMZ組均較 I/R組心功能得到改善(P<0.05),但BMSCs+TMZ組相比BMSCs組心功能改善的更加明顯(P<0.05)。5.與I/R組相比,BMSCs組和 BMSCs+TMZ組均能減少梗死面積(P<0.05),但BMSCs+TMZ組較BMSCs組的梗死面積要

8、減少的更多(P<0.05)。6.BMSCs+TMZ組Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯高于I/R和BMSCs組(P<0.05),BMSCs+TMZ組Bax蛋白表達(dá)水平明顯低于I/R和BMSCs組(P<0.05)。
　　結(jié)論:1、體外心肌細(xì)胞H/R與大鼠心肌I/R均可使LDH、MDA顯著升高,SOD顯著降低(成功模擬缺血再灌注微環(huán)境)。2、缺血再灌注微環(huán)境中存在的嚴(yán)重細(xì)胞毒性和氧化應(yīng)激不利于移植細(xì)胞存活。3、TMZ預(yù)處理BMSCs在缺血再灌