1、乳酸菌(LAB)對人體的益生作用表現(xiàn)在促進乳糖吸收、緩解便秘與一些空腸疾病、防止結(jié)腸癌、刺激免疫。研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌產(chǎn)生的胞外多糖(EPS)能夠刺激免疫，促進結(jié)腸炎的恢復。本論文篩選產(chǎn)生EPS的潛在益生乳酸菌，通過體外實驗研究EPS的抗突變活性與抗癌作用。 從自然發(fā)酵酸奶、DAHI，發(fā)酵竹筍與中國泡菜中分離得到235株乳酸菌。奶牛牛奶DAHI的(4.36和0.89％)、水牛牛奶DAHI(4.27和0.99％)與實驗室發(fā)酵酸奶三者的p

2、H和乳酸含量接近。DAHI、MESU與泡菜的菌相分析表明乳酸菌是其優(yōu)勢菌群。 采用平板檢驗(PA)胞外多糖的方法從235菌株篩選產(chǎn)粘菌株(MRS-s與m-MRS培養(yǎng)基)。將定性篩選產(chǎn)粘乳酸菌的方法改良，使其能夠有效的定量乳酸菌在固體培養(yǎng)基產(chǎn)生的粘性物質(zhì)。連同實驗室保存篩選自健康宿主口腔的乳酸菌菌株，共篩選得到50株不同表型的EPS產(chǎn)生菌株。在MRS-s培養(yǎng)基中，產(chǎn)粘菌中分別有28％(14株)、26％(13株)、40％(20株)具

3、有粘連、slimy、mucoidy的特性；在m-MRS培養(yǎng)基中，分別有28％(14株)、20％(7株)、40％(20株)的菌株具有粘連、slimy、mucoidy的特性。通過菌落與形態(tài)觀察，大部分菌株屬于乳桿菌屬。2.5℃培養(yǎng)時，根據(jù)糖源的不同，所有粘連菌株均表現(xiàn)出不同程度的粘性，但是在45℃培養(yǎng)時，菌株生長微弱，粘性完全消失。粘性物質(zhì)的產(chǎn)生對于糖源具有顯著的依賴性，蔗糖為最佳的篩選糖源。 3株分別來自發(fā)酵蔬菜、自然發(fā)酵牛乳與人

4、體口腔的菌株具有粘連、slimy、mucoidy的特性，采用API 50 CH試劑盒進行生理生化實驗，API鑒定系統(tǒng)的結(jié)果表明：3株菌分別為短乳桿菌NVC14、植物乳桿菌NYC30、干酪乳桿菌YHOC137(短乳桿菌YHOC137)。 不同溫度下，碳源對于菌體生長與EPS的產(chǎn)生具有明顯影響。37℃培養(yǎng)時，與5％蔗糖相比，5％葡萄糖更有利于菌體的生長與產(chǎn)酸，而30℃培養(yǎng)時，蔗糖轉(zhuǎn)化成：EPS的量更高。加熱、二氯醋酸處理以及蛋白酶降

5、解能夠降低發(fā)酵液中的蛋白含量，但每一步都會損失部分EPS。采用經(jīng)過膜(截留分子量為10kD)過濾的酵母膏，能夠?qū)⑴囵B(yǎng)基中碳水化合物的底物干擾從482.05 mg/L降低為232.03mg/L。論文還研究了不同培養(yǎng)基對于EPS產(chǎn)生的影響：NYC203菌株在SKM培養(yǎng)基中產(chǎn)量最低，但加入0.5％的酪蛋白水解物后EPS產(chǎn)量增加47.82％，達到198.09 mg/L；未優(yōu)化時，L．rhamnosus YHOC137的EPS產(chǎn)量在104.2 m

6、g/L-211.12 mg/L之間。L．brevis NVC14在25℃生長最好，但在37℃培養(yǎng)時EPS產(chǎn)量最大，達到104.18 mg/L；25℃培養(yǎng)時，L.plantarum NYC30粵L rhamnosusYHOC137的EPS產(chǎn)量分別為213 mg/L (1.92×10<'8>cfu/ml)、229.67 mg/L(21×10<'8>cfu/ml)。 根據(jù)L rhamnosus YHOCl37的生長與EPS的產(chǎn)生，設(shè)計

7、RWP(Reconstituted WheyPowder)培養(yǎng)基，即在RWP基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補充酵母膏、吐溫80、KH<,2>PO<,4>與Na<,3>C<,6>H<,5>O<,7>.2H<,2>O。L.rhamnosus YHOC137在RWP基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長良好，總菌數(shù)高于在標準MRS和SKM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的菌數(shù)。在非優(yōu)化條件下，較低的pH值(6.0)、添加YNB都可提高EPS的產(chǎn)量。 采用響應(yīng)面分析(RSM)優(yōu)化L．rhamno

8、sus YHOC137的培養(yǎng)條件，指標為菌體生長、EPS產(chǎn)量粵產(chǎn)酸量。回歸方程所得數(shù)學模型可直接估算產(chǎn)量和產(chǎn)率。方程預測EPS產(chǎn)量的最高點為27.18℃、28.1 h、YNB濃度22.94g/L；生物量的最高點為30.41℃、38.11Southern Yangtze University,Wuxi China，Master of Philosophy Degree Thesish、YNB濃度24.43 g/L；乳酸產(chǎn)生的最佳條件為28

9、.83℃、31.29 h、YNB濃度15.10g/LY。培養(yǎng)時間、溫度和YNB濃度顯著影響指標的產(chǎn)量。中溫(常溫)乳酸菌產(chǎn)生的EPS一般通過蛋白酶降解、離子交換層析(DEAE Sepharose C1-6B)粵凝膠過濾層析(Sepharose C1-6B)進行純化。流速、進樣量與緩沖強度影響EPS的純化效果。進行離子交換時，低離子強度(I=0.02)的緩沖液即能交換70-100mg的EPS，回收率可達85-90％。對于L．rhamnos

10、us YOHC137產(chǎn)生的高分子EPS而言，凝膠過濾層析能夠有效的對其進行分離，實驗條件為流速24 mL/h-30 ml/h、進樣量17.0-27.0 mg。 高效凝膠排阻色譜(HPSEC)分析表明，L．rhamnosus YOHC137產(chǎn)生的EPS分子量為1.7×10<'6> Da，L. brevis NVC14產(chǎn)生兩種EPS，分子量分別為1.2×10<'6>和4.9×10<'4>Da，L.plantarum NYC30產(chǎn)生的

11、EPS分子量為5.1×10<'6>和8.4×10<'4> Da。氣相色譜顯示葡萄糖與半乳糖為EPS的主要成分。傅立葉變換紅外光譜(FTIR)可以粗略的給出EPS結(jié)構(gòu)的大概信息以及α,β連結(jié)方式，并且可以確定典型的天然本質(zhì)，這對確定EPS的結(jié)構(gòu)具有很大幫助。另外發(fā)現(xiàn)L．rhamnosus YHOC137在延滯期產(chǎn)生糖基水解酶(glycohydrolase)。 L．rhamnosus YHOC137粵L. plantarum NYC

12、30在pH值3鹽酸溶液中可存活3 h，但在pH值2的鹽酸溶液中不能生存：兩菌在膽汁濃度為0.3％時存活時間很短：10<'4>CFU/ml的L.rhamnosus YHOC137能夠在膽汁濃度為0.5％情況下存活；冶藏10天后兩菌仍能發(fā)酵牛奶，表明其在冶藏條件下活力沒有明顯降低。 L．rhamnosus YHOC137與L.plantarum NYC30的活菌體與死細胞都能夠吸收50％強的誘變劑，其回收率很低，表明菌體細胞能夠吸附

13、誘變劑。L.rhamnosus YHOC137的發(fā)酵牛乳具有29.18％到38.91％的抗誘變活性：根據(jù)測試菌株的不同，其發(fā)酵牛乳的丙酮提取物的抗誘變活性從8.67％到54.46％不等。L.rhamnosus YHOC137產(chǎn)生的EPS對4NQNO具有中等活性，對2NF具有45.98％的活性。體外誘變性和體內(nèi)致癌性具有高度相關(guān)性。誘變劑的存在對DNA產(chǎn)生不可逆的損傷，導致癌變。可以應(yīng)用L.rhamnosusYHOC137產(chǎn)生的EPS和/