1、目前對于人類先天性脊柱側(cè)凸(CS)候選基因的研究尚處于初始的階段，在國內(nèi)尚是空白。近20年來對小鼠和雞胚胎發(fā)育的研究使我們對脊椎發(fā)育的分子胚胎學(xué)信息有了越來越多的了解。對于物種進(jìn)化而言，不同物種間在核苷酸序列和氨基酸序列上有較高的保守性?？梢酝ㄟ^系統(tǒng)回顧小鼠基因組數(shù)據(jù)庫就可以找到那些與脊椎畸形相關(guān)的基因，再通過基因圖的位置以同線性保守基因序列為基礎(chǔ)進(jìn)一步確立人類CS可能的候選基因。 研究目的: 通過對10個候選基因SNP

2、s的篩查，探索候選基因與人類CS之間的關(guān)聯(lián)，依據(jù)實驗結(jié)果提出可能的病因?qū)W假說； 通過對候選基因SNPs基因型與CS臨床表型的關(guān)聯(lián)分析，探索可能的致病基因，從遺傳學(xué)角度解釋CS臨床表型； 從基因水平探索候選基因與CS及CS臨床表型之間的關(guān)系。 研究方法：本研究采用病例—對照研究設(shè)計。 研究對象：根據(jù)入選和排除標(biāo)準(zhǔn)入選2005年10月～2008年5月期間在北京協(xié)和醫(yī)院脊柱中心收治且確診的154例中國漢族先天性

3、脊柱側(cè)凸(CS)患者和144例非先天性脊柱側(cè)凸的對照組。 研究方法： ·QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒提取全血DNA。 ·在NCBI—SNPs數(shù)據(jù)庫中查找上述10個基因中已知的SNPs。優(yōu)先選取雜合度高于10％，位于外顯子或有錯義突變的SNPs和位于3’—和5’—調(diào)控區(qū)的SNPs作為遺傳標(biāo)志，共選取了75個SNPs。 ·將病例組根據(jù)脊椎畸形臨床特點(diǎn)、脊椎畸形部位、是否合并肋骨畸形

4、將病例組進(jìn)行分層。 ·所有研究對象應(yīng)用VeraCode GoldenGate Genotyping Assay對所選的SNPs進(jìn)行基因型鑒定。 ·擬和優(yōu)度X2檢驗分析病例、對照組基因型頻率的分布是否符合H—W平衡。 ·對單個位點(diǎn)行基于基因型/等位基因頻率的關(guān)聯(lián)分析和基于基因型頻率的Logistic回歸分析，評估單個位點(diǎn)與CS發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性。 ·應(yīng)用Haploview和在線軟件SNPstats對單個基因內(nèi)

5、的多個位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析、單倍型關(guān)聯(lián)分析以及非條件Logistic回歸分析，評估單倍型與CS發(fā)生風(fēng)險的相關(guān)性。 研究結(jié)果： 共檢測了10個基因的75個位點(diǎn)，最終有11個位點(diǎn)被放棄，其中8個位點(diǎn)是因為檢出率較低，無法進(jìn)行進(jìn)一步的分析，另外3個位點(diǎn)是由于檢測結(jié)果顯示該位點(diǎn)無多態(tài)性而放棄，其余65個位點(diǎn)檢出率均>99.3％。 對照組中有2個基因共4個SNP位點(diǎn)的H—W平衡檢驗時P值<0.05，不符合H—W平衡，它們

6、是DLL3—rs2304222，MYLK—rs1254392，MYLK—rs820463，MYLK—rs9422。病例組中有3個基因共7個SNP位點(diǎn)的P值<0.05，不符合H—W平衡，它們是LMX1A—rs12029324，LMX1A—rs12023709，LMX1A—rs1819768，LMX1A—rs16841013，MYLK—rs9422，TBX6—rs3809624。 DLL3、DVL2、HES7、LMX1A、MYLK、

7、TBX6、WNT3A等7個基因內(nèi)的位點(diǎn)之間有連鎖不平衡關(guān)系。DLL3有四個位點(diǎn)(rs2304223、rs1110627、rs2304214和rs3212276)存在連鎖不平衡關(guān)系，組成連鎖不平衡block。 共篩選了DLL3的5個SNP位點(diǎn)：rs2304222，rs2304214，rs2304223，rs3212276，rs1110627。在對病例組和對照組行基于等位基因和基因型的單個位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析中并沒有得到與這5個位點(diǎn)相關(guān)的陽

8、性結(jié)果；在對單個位點(diǎn)的Logistic回歸分析中也未發(fā)現(xiàn)陽性位點(diǎn)；對DLL3中多個位點(diǎn)進(jìn)行單倍型關(guān)聯(lián)分析和Logistic回歸分析，均未發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果。在對病例組的臨床表型的進(jìn)一步分層分析中也沒有發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果。這說明這5個位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性和CS易感性無關(guān)，對中國漢族人群來說，DLL3基因的遺傳變異可能不是引起CS發(fā)病的主要因素。 共篩選了DVL2的5個SNP位點(diǎn)：rs222850，rs222837，rs222836，rs20742

9、16，rs2074222。在對病例組和對照組行基于等位基因和基因型的單個位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析中并沒有得到與這5個位點(diǎn)相關(guān)的陽性結(jié)果；在對單個位點(diǎn)的Logistic回歸分析中也未發(fā)現(xiàn)陽性位點(diǎn)；對DVL2中多個位點(diǎn)進(jìn)行單倍型關(guān)聯(lián)分析和Logistic回歸分析，均未發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果。在對病例組的臨床表型的進(jìn)一步分層分析中也沒有發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果，這說明這5個位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性和CS易感性無關(guān)，對中國漢族人群來說，DVL2基因的遺傳變異可能不是引起CS發(fā)病的主要因

10、素。 共篩選了HES7的3個SNP位點(diǎn)：rs1442849，rs3027279，rs1348325。結(jié)果提示HES7基因?qū)τ谟蟹止?jié)障礙和有胸椎畸形的先天性脊柱側(cè)凸發(fā)病來說是易感基因。 共篩選了LMX1A的13個SNP位點(diǎn)：rs4657412，rs12029324，rs12023709，rs12040140，rs6667188，rs1532815，rs1819768，rs6671290，rs16841029，rs46564

11、35，rs1354510，rs16841013，rs16840972。結(jié)果說明，LMX1A可能是有形成障礙的先天性脊柱側(cè)凸和有肋骨畸形的先天性脊柱側(cè)凸的易感基因。 共篩選了MYLK的8個SNP位點(diǎn)：rs1254392，rs3732487，rs40305，rs1350152，rs820463，rs9422，rs13080634，rs12172926。在對病例組和對照組行基于等位基因和基因型的單個位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析中并沒有得到與這8個位點(diǎn)

12、相關(guān)的陽性結(jié)果；在對單個位點(diǎn)的Logistic回歸分析中也未發(fā)現(xiàn)陽性位點(diǎn)；對MYLK中多個位點(diǎn)進(jìn)行單倍型關(guān)聯(lián)分析和Logistic回歸分析，均未發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果。在對病例組的臨床表型的進(jìn)一步分層分析中發(fā)現(xiàn)，在對腰椎畸形的CS組和對照組進(jìn)行比較時，兩個位點(diǎn)的基因型在兩組間存在顯著性差異；在對多位點(diǎn)單倍型的關(guān)聯(lián)分析和Logistic回歸分析時無陽性結(jié)果。這說明MYLK基因可能是腰椎畸形的先天性側(cè)凸發(fā)病的易感基因。 共篩選了NOTCH1的

13、5個SNP位點(diǎn)：rs2229971，rs10521，rs2229974，rs6563，rs4489420。在對病例組和對照組行基于等位基因和基因型的單個位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析中并沒有得到與這5個位點(diǎn)相關(guān)的陽性結(jié)果，對單個位點(diǎn)Logistic回歸分析、多位點(diǎn)單倍型關(guān)聯(lián)分析和Logistic回歸分析時也無陽性結(jié)果。在對病例組的臨床表型的進(jìn)一步分層分析中也沒有發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果，這說明這5個位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性和CS易感性無關(guān)，對中國漢族人群來說，NOTCH1基

14、因的遺傳變異可能不是引起CS發(fā)病的主要因素。 共篩選了PAX1的3個SNP位點(diǎn)：rs17861031，rs6047590，rs6035934。在對病例組和對照組行基于等位基因和基因型的單個位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析中我們并沒有得到與這3個位點(diǎn)相關(guān)的陽性結(jié)果，對單個位點(diǎn)Logistic回歸分析、多位點(diǎn)單倍型關(guān)聯(lián)分析和Logistic回歸分析時也無陽性結(jié)果。在對病例組的臨床表型的進(jìn)一步分層分析中也沒有發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果，這說明這3個位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性和C

15、S易感性無關(guān)，對中國漢族人群來說，PAX1基因的遺傳變異可能不是引起CS發(fā)病的主要因素 共篩選了SIM2的3個SNP位點(diǎn)：rs2073416，rs2051397，rs2073601。這3個位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性和CS易感性無關(guān)，對中國漢族人群來說，SIM2基因的遺傳變異可能不是引起CS發(fā)病的主要因素。 篩選了TBX6基因的2個SNP位點(diǎn)：rs8060511和rs3809624。實驗結(jié)果提示TBX6基因是中國漢族人群先天性脊柱側(cè)

16、凸的易感基因，進(jìn)一步的分析說明TBX6基因?qū)τ蟹止?jié)障礙的先天性脊柱側(cè)凸、無肋骨畸形的先天性脊柱側(cè)凸、有肋骨畸形的先天性脊柱側(cè)凸以及有胸椎畸形的先天性脊柱側(cè)凸均有關(guān)聯(lián)。 共篩選了WNT3A基因中的17個SNP位點(diǎn)。在對病例組和對照組行基于等位基因和基因型的單個位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析中并沒有得到與這17個位點(diǎn)相關(guān)的陽性結(jié)果分析結(jié)果說明WNT3A遺傳多態(tài)性和CS易感性無關(guān)，對中國漢族人群來說，WNT3A基因的遺傳變異可能與CS發(fā)病相關(guān)聯(lián)，進(jìn)一步

17、的分析說明WNT3A基因?qū)o肋骨畸形的先天性脊柱側(cè)凸、有肋骨畸形的先天性脊柱側(cè)凸以及有胸椎畸形的先天性脊柱側(cè)凸均有關(guān)聯(lián)。 結(jié)論： 在中國漢族人群中HES7、LMX1A、TBX6和WNT3A基因多態(tài)性與先天性脊柱側(cè)凸發(fā)病相關(guān)，有可能是決定CS個體遺傳易感性的重要因素。 HES7基因?qū)τ谟蟹止?jié)障礙和有胸椎畸形的先天性脊柱側(cè)凸發(fā)病來說是易感基因；LMX1A可能是有形成障礙的先天性脊柱側(cè)凸和有肋骨畸形的先天性脊柱側(cè)凸的易