1、先天性心臟病(Congenital heart disease，CHD)，簡(jiǎn)稱先心，是圍產(chǎn)兒最常見的出生缺陷。世界范圍內(nèi)先心的發(fā)病率在足月、活產(chǎn)的新生兒約為0.80％，在成年人中約為0.40％，其中散發(fā)型非綜合征型先心患者占絕大多數(shù)。我國衛(wèi)生部2012年9月發(fā)布的《中國出生缺陷防治報(bào)告》數(shù)據(jù)顯示，我國圍產(chǎn)期先心發(fā)病率呈快速上升趨勢(shì)，每年新增病例18萬～22萬。
　　心臟發(fā)育經(jīng)歷了心管形成、環(huán)化、內(nèi)部分隔、血管連接等過程，任何環(huán)節(jié)遭

2、到干擾都可能引起先天性缺陷。流行病學(xué)研究顯示，盡管環(huán)境危險(xiǎn)因素與先心發(fā)病有關(guān)，但在致病過程中發(fā)揮主導(dǎo)作用的是遺傳危險(xiǎn)因素。先心的表型復(fù)雜多樣，臨床亞型多達(dá)幾十種，其病因機(jī)制存在明顯的異質(zhì)性。本課題組對(duì)先心復(fù)雜的遺傳危險(xiǎn)因素如單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）等進(jìn)行了一系列研究。但目前，針對(duì)先心開展的全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome-wideAssociation Studies，GWAS

3、)還未有報(bào)道。
　　近年來，GWAS已經(jīng)逐漸成為人們探究常見復(fù)雜性疾病遺傳易感性的有力“武器”，它的優(yōu)勢(shì)在于不基于任何病因假設(shè)，不局限于已知基因/通路，能夠?qū)⒀芯糠秶鷶U(kuò)大到整個(gè)基因組的遺傳變異，可為先心遺傳易感因素研究提供新的線索?；诙嚯A段病例-對(duì)照研究設(shè)計(jì)，我們首次在中國人群中開展先心GWAS研究，對(duì)大樣本人群全基因組SNPs進(jìn)行掃描，繼而在獨(dú)立病例-對(duì)照樣本中進(jìn)行多階段驗(yàn)證，探究與中國人群先心發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的常見易感位點(diǎn)。為了

4、控制遺傳異質(zhì)性的影響，鑒別真正的遺傳危險(xiǎn)因素，本研究選擇先天性心臟間隔缺損患者作為主要研究對(duì)象，包括房間隔缺損(Atrial septal defects，ASD)、室間隔缺損(Ventricular septal defects，VSD)及房間隔缺損合并室間隔缺損(ASD/VSD)。在此基礎(chǔ)上，我們還對(duì)由于頻率較低或效應(yīng)微弱未能被GWAS闡明的部分位點(diǎn)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本驗(yàn)證，以期發(fā)現(xiàn)更多與先心發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)的常見遺傳變異。
　　本

5、研究作為首個(gè)在中國人群中開展的先心GWAS，將有助于我們發(fā)現(xiàn)新的中國人群遺傳易感位點(diǎn)，提示易感基因及通路，為先心的分子生物學(xué)研究提供線索;新發(fā)現(xiàn)的易感位點(diǎn)能夠增加人們對(duì)先心遺傳貢獻(xiàn)的認(rèn)知，完善先心遺傳易感圖譜;此外，還有望將新發(fā)現(xiàn)的標(biāo)志物用于遺傳學(xué)咨詢，預(yù)測(cè)人群子代先心患病風(fēng)險(xiǎn)，篩查子代先心高危人群，并為早期診斷和治療提供數(shù)據(jù)支持。
　　第一部分中國漢族人群先天性心臟病全基因組關(guān)聯(lián)研究
　　近年來，全世界范圍內(nèi)先心發(fā)病率不斷

6、攀升，已經(jīng)成為最常見的出生缺陷，嚴(yán)重影響人類生命健康。既往研究表明，先心作為一種復(fù)雜性疾病，是由環(huán)境因素與個(gè)體遺傳因素共同決定的，其中遺傳因素發(fā)揮主導(dǎo)作用。研究者們對(duì)先心遺傳易感性的研究多基于候選基因策略，并且僅有少數(shù)已知致病基因上的少數(shù)遺傳變異被發(fā)現(xiàn)與先心發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。關(guān)于先天性心臟病的GWAS研究目前還尚未有相關(guān)報(bào)道。因此，開展先心GWAS將有望幫助人們發(fā)現(xiàn)更多中低外顯度的先心常見遺傳易感位點(diǎn)。
　　本研究運(yùn)用高通量分型平臺(tái)—

7、Illumina HumanOmniZhonghua-8全基因組基因分型芯片，對(duì)945名明確診斷為散發(fā)型非綜合征型先心(ASD、VSD以及ASD/VSD)患者及1246名來自同一地區(qū)、無出生缺陷和心臟疾病的對(duì)照進(jìn)行了全基因組常見遺傳變異檢測(cè)。經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量控制，我們我們運(yùn)用logistics回歸中的相加模型對(duì)708275個(gè)合格SNPs進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。8個(gè)SNPs在病例和對(duì)照中差異顯著（關(guān)聯(lián)研究中P≤1×10-5為驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)）進(jìn)入后續(xù)三階段

8、獨(dú)立樣本驗(yàn)證，驗(yàn)證平臺(tái)采用Taqman基因分型平臺(tái)。第一、第二階段驗(yàn)證樣本為來自南京和西安地區(qū)的2160名先心(ASD、VSD以及ASD/VSD)患者及3866名對(duì)照。結(jié)果顯示，rs2474937在兩階段驗(yàn)證中均顯示出與先心發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)，與初篩一致，其突變基因型[C]顯著增加先心發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)（第一階段:OR=1.35，P=9.97×10-5;第二階段:OR=1.27，P=9.97×10-5）。rs1531070在先心病例和對(duì)照中的頻率也

9、表現(xiàn)出顯著差異，其突變基因型[A]與先心發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加顯著相關(guān)（第一階段:OR=1.29，P=2.70×10-4;第二階段:OR=1.36，P=2.32×10-3）。進(jìn)入驗(yàn)證階段的其余6個(gè)、 SNP(rs17019472，rs10182004，rs9461938，rs72759270，rs9533839和rs9533839)的基因型與發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無顯著關(guān)聯(lián)(P＞0.05)。合并初篩及第一、二階段驗(yàn)證所有樣本后分析顯示，兩個(gè)陽性SNPs的變異等

10、位基因型分別顯著增加先心的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)至1.40倍，并且均達(dá)到GWAS研究統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著水平(rs2474937P=8.44×10-10，rs1531070 P=4.99×10-12)。為了探究其他先心亞型中SNP的關(guān)聯(lián)情況，我們特別納入了1180名除了ASD、VSD及ASD/VSD外的其他先心亞型來進(jìn)行第三階段驗(yàn)證。結(jié)果顯示，兩個(gè)SNPs與其他亞型先心發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)也顯著相關(guān)(rs2474937 OR=1.32,P=2.00×10-3; rs153

11、1070 OR=1.20,P=1.40×10-2)。我們進(jìn)一步根據(jù)先心不同亞型進(jìn)行分層分析。本研究中納入的先心患者主要亞型有4種—ASD、VSD、ASD/VSD以及PDA。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)SNPs與四種先心的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度類似，OR介于1.30至1.58之間，并且亞組間異質(zhì)性分析沒有發(fā)現(xiàn)顯著異質(zhì)性（rs2474937的異質(zhì)性檢驗(yàn)P=0.546;rs1531070的異質(zhì)性檢驗(yàn)P=0.428）。
　　綜上所述，本研究鑒定了位于1p12和4q3

12、1.1的中國人群先心易感區(qū)域，填補(bǔ)了先心GWAS研究數(shù)據(jù)的空白，發(fā)現(xiàn)的遺傳易感位點(diǎn)可為先心的早期篩查提供候選標(biāo)志物。
　　第二部分中國漢族人群先天性心臟病全基因組關(guān)聯(lián)研究擴(kuò)大驗(yàn)證
　　如第一部分所述，本課題組開展了首個(gè)中國人群先心GWAS研究，采用大樣本、多階段病例-對(duì)照研究設(shè)計(jì)，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)中國人群易感區(qū)域—1p12和4q31.1區(qū)域。與此同時(shí)，英國的紐卡斯?fàn)柎髮W(xué)Cordell等人在高加索人群中開展了先心GWAS研究，發(fā)現(xiàn)了

13、與歐洲人群ASD和法洛四聯(lián)癥(Tetralogy of Fallot，TOF)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)的常見遺傳變異。這些GWAS研究為進(jìn)一步探索先心分子生物學(xué)機(jī)制提供了非常有價(jià)值的線索。
　　然而，GWAS研究一般僅選擇少數(shù)關(guān)聯(lián)P值最小的峰值SNPs進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證，在降低假陽性的同時(shí)可能遺漏了大最效應(yīng)較弱的易感位點(diǎn)和（或）區(qū)域，因此每個(gè)GWAS研究均只鑒別到少數(shù)遺傳易感位點(diǎn)，能夠解釋的遺傳力非常有限。為了發(fā)現(xiàn)更多的易感位點(diǎn)和（或）區(qū)域，我

14、們降低篩選標(biāo)準(zhǔn)，擴(kuò)大驗(yàn)證范圍，對(duì)全基因組關(guān)聯(lián)分析中P值1.0×10-4-1.0×10-5的45個(gè)候選SNPs進(jìn)行驗(yàn)證。第一階段驗(yàn)證采用Sequenom MassARRAY分型平臺(tái)，驗(yàn)證人群為來源于南京的2270名先心(ASD，VSD，ASD/VSD)患者及3911名對(duì)照。4個(gè)SNPs與先心發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有顯著關(guān)聯(lián)—rs1400558，rs7863990和rs490514的變異基因型均能夠顯著增加先心發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)(rs1400558 OR=1.13

15、，P=1.18×103; rs7863990 OR=1.20，P=3.00×10-3;rs490514 OR=1.15，P=8.75×10-5)，而rs2433752的變異基因型與先心風(fēng)險(xiǎn)降低有顯著關(guān)聯(lián)（OR=0.86，P=8.31×10-4）。其余41個(gè)SNPs基因型頻率在病例和對(duì)照中的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)4個(gè)顯著關(guān)聯(lián)SNPs進(jìn)行第二階段驗(yàn)證，納入來自西安的1095例ASD、VSD以及ASD/VSD患者及2379名非先心對(duì)照?；蚍?/p>

16、型采用Taqman分型平臺(tái)，結(jié)果顯示驗(yàn)證的4個(gè)SNPs都與先心發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)（P≤0.05），并且效應(yīng)方向與初篩及第一階段驗(yàn)證保持一致(rs1400558 OR=1.15，P=9.11×10-3; rs7863990 OR=1.28,P=6.30×10-3; rs2433752 OR=0.79，P=4.68×10-4;rs490514 OR=1.16，P=5.33×10-3)。此外，我們納入來自南京和西安的2188名除ASD、VSD以

17、及ASD/VSD外的其他類型先心患者和來自于同地區(qū)的1120名非先心對(duì)照作為第三階段驗(yàn)證人群，結(jié)果表明這4個(gè)SNPs也與其他亞型先心發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)(rs1400558 OR=1.18，P=2.91×10-3; rs7863990 OR=1.45，P=1.76×10-5; rs2433752 OR=0.82，P=1.23×10-3; rs490514OR=1.22，P=1.96×10-4)。
　　我們對(duì)本研究中包括各種亞型先心在內(nèi)

18、的全部病例及全部對(duì)照進(jìn)行合并分析，結(jié)果顯示rs14005584，rs7863990和rs490514這3個(gè)SNPs的突變基因型都能顯著增加先心發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，而rs2433752的突變基因型則能夠顯著降低先心發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，并且均達(dá)到GWAS研究統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著水平（rs1400558 OR=1.15，P=1.63×10-9;rs7863990OR=1.34，P=3.71×10-14; rs2433752 OR=0.83，P=1.04×10-10; rs

19、490514OR=1.19，P=1.20×10-13)。此外，我們與英國Cordell課題組合作，歐洲人群中發(fā)現(xiàn)rs490514也與歐洲人群先心發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)（OR=1.18，P=3.40×10-3）。
　　進(jìn)一步在本研究中涉及的5種主要先心亞型—ASD、VSD、ASD/VSD、PDA以及TOF中對(duì)上述的4個(gè)陽性SNPs進(jìn)行分層分析，發(fā)現(xiàn)rs2433752和rs490514與5種先心亞型發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)方向相同，亞組間關(guān)聯(lián)強(qiáng)度無顯

20、著異質(zhì)性（rs2433752異質(zhì)性P=0.249; rs490514異質(zhì)性P=0.193）。而對(duì)rs1400558和rs7863990的分析結(jié)果則顯示，它們對(duì)不同亞型的效應(yīng)有顯著性差異（異質(zhì)性P值分別為0.015和0.007）。rs1400558的突變基因型能顯著增加其他4種亞型的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，但在對(duì)PDA的分析中得到相反的效應(yīng)方向，關(guān)聯(lián)達(dá)不到顯著性水平（OR=0.88，P=1.24×10-1）;rs7863990與5種亞型間都有顯著關(guān)聯(lián)，