1、目的：構建、并觀察攜帶人-β-NGF(nervegrowthfactor,神經生長因子)重組質粒的骨髓基質干細胞(bone marrow stromalstem cell,BMSC)的生物學特性,為應用β-NGF修飾的BMSC進行耳蝸移植治療老年聾的動物實驗研究提供支持。
　　方法：將含有重組質粒的陽性克隆大腸桿菌接種至37℃預溫的LB培養(yǎng)基中,37℃震蕩培養(yǎng)24小時進行細菌擴增,取擴增好的菌夜按質粒提取試劑盒說明提取重組質粒,提

2、取成功后對其進行HindIII、XhoI雙酶切鑒定,-20℃保存?zhèn)溆?。復蘇小鼠骨髓基質干細胞,流式細胞學鑒定其表面CD標記,然后將GFP轉基因的小鼠骨髓基質干細胞分為四組:A組為脂質體2000包裹的重組質粒轉染組;B組為脂質體轉染組;C組為脂質體包裹的空質粒轉染組;D組為含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液的陰性對照組。采用脂質體LipofectamineTM2000轉染方法將含有人β-NGF神經生長因子的重組質粒轉染至含有GFP基

3、因的小鼠骨髓基質干細胞中,在倒置光學顯微鏡下對比各組細胞的數(shù)量及觀察細胞突起的生長情況,收集各組細胞的上清液,分別利用酶聯(lián)免疫吸附實驗的方法檢測各組細胞培養(yǎng)液中人-β-NGF基因的表達情況。
　　結果：重組質粒pcDNA3-β-NGF經限制性內切酶HindIII和XhoI雙酶切后,限制性內酶切片段長度與插入基因片段相符約725bp;將重組質粒按脂質體LipofectamineTM2000操作說明書進行轉染,倒置光學顯微鏡下觀察到各

4、組細胞生長情況不同:實驗組細胞生長狀態(tài)良好,而脂質體轉染組及空質粒組細胞生長狀態(tài)較差,大量細胞出現(xiàn)胞膜不明顯,細胞核碎裂,細胞形態(tài)混亂,空白對照組細胞無明顯改變。于轉染后48小時換液,收集各組細胞上清液,并用ELISA測定各組中是否有人-β-NGF蛋白的表達情況。NGF蛋白ELISA檢測結果:A、重組質粒組為174.91±4.71pg/ml,B、空質粒組為5.94±0.91pg/ml,C、Lip2000組為5.71±0.50pg/ml,

5、D、陰性對照組為5.79±0.80pg/ml,重組質粒組NGF蛋白表達量明顯比其他各組NGF蛋白表達量高。
　　結論：采用脂質體LipofectamineTM2000轉染方法能成功的將NGF重組質粒轉染至骨髓基質干細胞,經轉染后攜帶NGF質粒的小鼠骨髓基質干細胞仍有增殖、分化能力,并且具有了NGF蛋白的表達能力,其表達的NGF蛋白能有效的保護轉染過程中對細胞的損害,這些研究結果,可以為我們下一步應用β-NGF修飾的BMSC進行耳蝸