1、黃萎病是棉花生產(chǎn)的重要病害,導(dǎo)致棉花的質(zhì)量與產(chǎn)量下降,影響棉花生產(chǎn)的經(jīng)濟效益.采用生物技術(shù)與常規(guī)育種方法相結(jié)合,分離棉花抗病相關(guān)基因,定向培育抗病新品種,是控制病害最簡單易行且行之有效的途徑.本文采用RT-PCR方法對受8種病原菌毒素、2種激素處理的棉花幼苗進行檢測,分析通過抑制消減雜交、同源克隆等技術(shù)所獲的22條cDNA序列的表達特性.在所檢測的基因中有19個能夠被大麗輪枝菌(VerticiUium dahliae)誘導(dǎo)表達,17個能

2、夠被黑曲霉(Aspergillus niger van Tiegh)誘導(dǎo)表達,且GhPR10、GhPRG、GhGT、GhCOX和GhVDRGll能夠應(yīng)答大多數(shù)病原菌的侵染,棉花抗黃萎相關(guān)基因GhVE1則能夠被V. dahliae特異誘導(dǎo)表達.GhPR10、GhLRR、GhGGH和GhVDRG11屬于瞬時表達的基因,在10min內(nèi)即可被檢測到;30min～90min范圍內(nèi)共有14個基因被誘導(dǎo)表達.在6h有15個基因共同表達,包括GhVE2

3、、GhEH和受黃萎病菌特異誘導(dǎo)的GhVE1.此外GhEH、GhZFP、GhVE1、GhVE2、GhLRR和GhGGH在軍棉1號、中棉12、海7124和L12四個不同抗性品種的表達也存在差異.激素誘導(dǎo)的結(jié)果表明,GhPR10能夠被SA和ABA誘導(dǎo)表達,GhDIR和參與糖基轉(zhuǎn)移的GhGT受SA誘導(dǎo)表達,ABA上調(diào)GhVE1而負調(diào)控GhTMR的表達.綜合表達特性檢測結(jié)果,推測棉花對黃萎病的抗性存在兩個防御時期,瞬時基礎(chǔ)防御和滯后特異性防御.基

4、礎(chǔ)防御的基因表達在30min之內(nèi)已經(jīng)完成,滯后特異性防御的基因表達在6h形成.GhPR10、GhPRG、GhCPH、GhPDR和GhTMR是瞬時基礎(chǔ)防御的核心基因,GhVE1、GhVE2和GhLRR則屬于滯后特異性防御基因.ABA和SA主要參與調(diào)控基礎(chǔ)防御的核心基因和滯后特異性防御基因. 文中采用RACE、TAIL-PCR等技術(shù)，分離重要的候選基因GhPR10、GhEH、GhPRG、GhZFP、GhERF初GhDIR.GhPR1

5、0(DQ123838)cDNA全長774bp,讀碼框474bp,編碼157aa,含有一個108bp內(nèi)含子, 分離到起始密碼子上游1537bp,推測為病程相關(guān)蛋白Bet v I家族;GhEH(DQ123837)cDNA全長1571bp,讀碼框1160bp,編碼315aa,含有四個內(nèi)含子,分別為119bp、81bp、83bp和127bp,推測為環(huán)氧化物水解酶;GhERF(DQ372577)cDNA全長為1319bp,讀碼框為1137bp,編

6、碼378 aa,推測為乙烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白;GhZFP(DQ372575)cDNA全長為768bp,讀碼框516bp,編碼171aa,推測為鋅指結(jié)構(gòu)蛋白;GhPRG(DQ372577)cDNA全長為序列1020bp,編碼264aa,推測為細胞壁組分;GhDIR cDNA全長為序列765bp,編碼176aa,推測為與木質(zhì)化有關(guān)的基因. 本文采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥,對GhPR10基因進行功能初步驗證,共獲得34株GhPRI

7、O轉(zhuǎn)基因煙草單株.離體葉片抗病性鑒定表明,GhPR10的過量表達能夠明顯提高煙草對黃萎病菌的抗性.對轉(zhuǎn)基因煙草葉片的總黃酮含量測定表明,1g風(fēng)干的GhPR10轉(zhuǎn)基因煙草葉片總黃酮含量最高達1.10mg,平均含量為0.883mg,而對照則只有0.375mg,轉(zhuǎn)煙草總黃酮的含量較對照提高1倍,表明GhPR10能夠提高植物抗菌素黃酮類化合物的水平.轉(zhuǎn)基因擬南芥實驗也表明,GhPR10能夠提高擬南芥對黃萎病菌和鹽脅迫的耐受性.此外,GhPR10