1、棉花黃萎病(Cotton VerticiUium Wilt)是影響棉花產(chǎn)量和品質(zhì)的主要病害,因此研究棉花抗黃萎病機(jī)制,篩選抗病相關(guān)基因,對(duì)培育抗黃萎病棉花品種具有重要意義.本研究克隆了通過(guò)抑制消減雜交獲得的差異表達(dá)序列Vdrg2的全長(zhǎng)cDNA,生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該基因與.ABA信號(hào)調(diào)控相關(guān)的蛋白磷酸酯酶2C同源,故命名為GhPP2C.采用RT-PCR檢測(cè)了不同抗性棉花品種受不同黃萎病菌毒素處理后,該基因不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)特性,并通過(guò)農(nóng)桿菌

2、介導(dǎo)將GhPP2C導(dǎo)入擬南芥,初步鑒定了該基因的功能. 利用RACE技術(shù)克隆了GhPP2C基因5'端序列,獲得全長(zhǎng)cDNA序列為1471bp,開(kāi)放讀碼框(Open Reading Frame,ORF)為1251bp,編碼416個(gè)氨基酸.DNA水平檢測(cè)表明該基因含有3個(gè)內(nèi)含子,分別為98bp、341bp和96bp.BLAsT比對(duì)結(jié)果表明,該基因?qū)儆诘鞍琢姿狨ッ?C(PP2C)家族,與ABA信號(hào)調(diào)控的磷酸酯酶2C家族AHG3(ABA

3、-Hypersensitive Germination 3)同源性高達(dá)59﹪. 分別以低致病力菌株VDKll4和高致病力菌株VDK991的毒素粗提液,處理三個(gè)抗病性不同的棉花品種7日齡幼苗,分別在處理后2h、6h、12h和24h取樣進(jìn)行RT-PCR檢測(cè).結(jié)果表明,在高致病力菌株VDK991毒素處理下,抗病品種海島棉06 GhPP2C從12h開(kāi)始表達(dá)并持續(xù)到24h,耐病品種中棉12和感病品種中植86-1僅在2h表達(dá);不同棉花品種受

4、低致病力菌株VDK114毒素誘導(dǎo)GhPP2C的表達(dá)則比較復(fù)雜,抗病品種在6-24h能夠表達(dá),耐病品種在2-12h能夠表達(dá),而感病品種僅在12h表達(dá).半定量PCR分析表明GhPP2C表達(dá)水平與品種的抗病性之間不存在顯著相關(guān).綜上結(jié)果說(shuō)明,棉花品種的抗性與GhPP2C的時(shí)間表達(dá)特性存在一定的負(fù)相關(guān),即在高致病菌侵染感病品種條件下,GhPP2C表達(dá)時(shí)間短,且GhPP2C在高致病菌侵染抗病品種時(shí)表達(dá)時(shí)間滯后.中棉12幼苗受脫落酸(ABA)、乙烯

5、(ET)和水楊酸(SA)處理后,GhPP2C表達(dá)特性的分析表明,ET能夠抑制該基因在幼苗莖中的表達(dá),而對(duì)葉片沒(méi)有影響,ABA和SA不影響該基因的正常表達(dá). 采用PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變法對(duì)GhPP2C推測(cè)的活性位點(diǎn)進(jìn)行改造(Asp<,152>-Gly<,152>),獲得突變基因GhM152,并構(gòu)建了GhPP2C和突變基因GhM152的表達(dá)載體pBIPP2C和pBIM152,轉(zhuǎn)入擬南芥Columbia生態(tài)型,獲得了轉(zhuǎn)基因植株.對(duì)轉(zhuǎn)Gh

6、PP2C擬南芥植株在添加外源ABA和GA的1/2 MS培養(yǎng)基中觀察其萌發(fā)和生長(zhǎng)情況.結(jié)果表明,在高濃度ABA(20-100 μmol/L)處理下,轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型萌發(fā)后均不能繼續(xù)發(fā)育,而在低濃度ABA(1-2.5μmol/L)條件下,轉(zhuǎn)基因擬南芥的根長(zhǎng)與野生型植株根長(zhǎng)沒(méi)有差別,轉(zhuǎn)基因植株的莖極顯著(P<0.001)長(zhǎng)于野生型植株莖長(zhǎng),表明GhPP2C能夠提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)ABA的耐受性.添加20-100μmol/L的GA,轉(zhuǎn)基因擬南