1、本文以星突江鰈（Platichthysstellatus）為研究對象，運用 RACE方法克隆了星突江鰈生長激素(GH, Growth hormone）、胰島素樣生長因子 I和Ⅱ(IGF-I,Ⅱ;Insulin-like growth factor-I,Ⅱ)的cDNA序列，采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測了GH、IGF-I和IGF-ⅡmRNA在不同胚胎、仔稚魚發(fā)育階段和成魚不同組織中的時空表達模式；運用實時熒光定量技術(shù)結(jié)合組織學及激素放射免

2、疫測定技術(shù)對 GH、IGF-I和IGF-Ⅱ在星突江鰈卵巢發(fā)育中的調(diào)節(jié)作用進行了初步研究；最后利用原核表達技術(shù)實現(xiàn)了星突江鰈GH、IGF-I和IGF-II成熟肽體外重組表達和生物活性檢測，獲得了具有生物活性的重組蛋白。本研究結(jié)果為揭示星突江鰈生長發(fā)育調(diào)控機制及健康養(yǎng)殖技術(shù)構(gòu)建提供了基礎(chǔ)資料和理論支撐。主要研究結(jié)果如下：
　　1.星突江鰈GH、IGF-I和IGF-Ⅱ的基因克隆和組織表達分析
　　采用RACE方法，首次從星突江鰈垂

3、體中克隆到GH cDNA全長序列，從肝臟中克隆到IGF-I和IGF-Ⅱ cDNA全長序列。星突江鰈GH基因全長957bp，編碼204個氨基酸，其中成熟肽包含180個氨基酸，含有4個保守的半胱氨酸殘基和1個C端糖基化位點。IGF-I和IGF-II基因cDNA全長分別為1268bp和899bp，各編碼185個和215個氨基酸，切除信號肽和E區(qū)后分別形成包含B-C-A-D區(qū)的141個和168個氨基酸的成熟肽，均有高度保守的6個半胱氨酸殘基，形

4、成3對二硫鍵。
　　實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，星突江鰈GH mRNA主要在垂體中表達，此外在腦、性腺、胃和肌肉中有微量表達，且雌魚胃和肌肉的GH mRNA表達量高于雄魚。IGF-I mRNA主要在肝臟中表達，所檢測的其他12個組織中也均有相對較低表達，且雌魚肝臟、性腺、鰓、心臟和腎臟中 IGF-I mRNA表達量高于雄魚，而在垂體中則相反（P＜0.05）。IGF-ⅡmRNA主要在雌魚肝臟中表達，而在雄魚肝、腦和鰓均有較高表達，其

5、他所檢測組織中也有低量表達，且雌魚垂體、性腺、肝臟、心臟、頭腎、腎、脾臟、胃和腸中IGF-ⅡmRNA表達量高于雄魚，而雌魚腦中IGF-ⅡmRNA卻低于雄魚（P＜0.05）。雌雄魚組織間GH、IGF-I和IGF-ⅡmRNA表達差異顯示GH/IGFs軸可能與星突江鰈的性別二態(tài)性生長特性有關(guān)。
　　2.星突江鰈GH、IGF-I和IGF-ⅡmRNA在早期生長發(fā)育中的表達特性
　　實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，星突江鰈GH mRNA在胚

6、胎發(fā)育階段未檢測到表達，最早在1日齡仔魚中檢測到表達，表達水平在1-60日齡內(nèi)隨苗種生長發(fā)育而逐漸升高（P＜0.05）。IGF-I和IGF-Ⅱ mRNA在未受精卵和胚胎發(fā)育中均表達，IGF-I mRNA在受精卵至高囊胚期表達量較高（P＜0.05），原腸后期明顯下降（P＜0.05）至初孵仔魚維持在較低水平，在1-60日齡內(nèi)隨苗種生長發(fā)育而逐漸升高（P＜0.05）。IGF-Ⅱ低囊胚期前表達量較低，低囊胚期時達峰值而后逐漸下降（P＜0.05）

7、至初孵仔魚達最低值達到，在1-18日齡內(nèi)表達量逐漸升高（P＜0.05）而后逐漸降低（P＜0.05）。上述結(jié)果表明GH、IGF-I和IGF-II可能在星突江鰈的早期生長發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮重要作用。
　　3.星突江鰈GH、IGF-I和IGF-II對卵巢發(fā)育的調(diào)控機制研究
　　利用組織切片技術(shù)將星突江鰈卵巢年周期發(fā)育過程劃分為Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ5個時期。血漿激素放射免疫測定結(jié)果和實時熒光定量PCR結(jié)果表明，星突江鰈卵巢發(fā)育Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期

8、垂體GH mRNA表達量及血漿GH均處于較低水平（P＜0.05），而肝臟IGF-I mRNA表達量及血漿IGF-I表達水平隨卵巢發(fā)育而逐漸升高至Ⅴ期達到峰值，排卵結(jié)束后顯著下降（P＜0.05）。卵巢IGF-I和IGF-ⅡmRNA表達水平隨卵巢發(fā)育逐漸升高至Ⅵ期時達到最高值（P＜0.05）。血漿T水平隨卵巢發(fā)育升高至Ⅴ期達峰值，排卵后顯著下降（P＜0.05）；血漿E2也隨卵巢發(fā)育升高但在Ⅳ期達峰值，后在Ⅴ、Ⅵ期顯著下降（P＜0.05）。上

9、述結(jié)果顯示GH、IGF-I和IGF-Ⅱ可能通過自分泌、內(nèi)分泌和旁分泌等多種途徑參與到星突江鰈卵巢發(fā)育調(diào)控過程。
　　4.星突江鰈GH、IGF-I和IGF-Ⅱ成熟肽的原核表達及活性分析
　　根據(jù)克隆得到的星突江鰈GH、IGF-I和IGF-ⅡcDNA全長序列，設(shè)計帶酶切位點引物克隆得到GH、IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ成熟肽序列。利用PCR方法將擴增片段連接到原核表達載體 pET-28a上，得到的重組質(zhì)粒導入到大腸桿菌 BL21(DE

10、3)后經(jīng)IPTG誘導產(chǎn)生N端含His標簽的融合蛋白。以SDS-PAGE電泳檢測和SigmaScan軟件分別確定GH、IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ重組蛋白誘導的最佳溫度、誘導劑濃度和時間，得到的GH、IGF-I和IGF-Ⅱ成熟肽重組蛋白分別占細菌總蛋白的45.2％、39.8%和42.7%，重組蛋白均以包涵體形式存在。Western blotting方法驗證所獲得的蛋白均可特異性被6×His抗體識別并且蛋白分子量大小合適，誘導表達蛋白后的菌液沉淀

11、經(jīng)6mol/L鹽酸胍變性、Ni2+離子親和柱純化和尿素梯度復(fù)性，分別獲得大小為24.9kD、12.1kD和11.4kD的純化蛋白。利用人胚胎腎細胞HEK293T進行細胞增殖誘導實驗證明，IGF-I和IGF-Ⅱ重組蛋白均具有低濃度促進和高濃度抑制細胞增殖的生物活性，而 GH重組蛋白則僅在高濃度條件下表現(xiàn)出抑制活性。星突江鰈GH、IGF-I和IGF-Ⅱ重組蛋白的獲得為魚類GH/IGFs生理功能研究和專用綠色高效生長添加劑的開發(fā)提供了基礎(chǔ)資料