1、流行性感冒是一種由流感病毒引起的上呼吸道傳染病。流感極易在人群中傳播，歷史上幾次流感的大流行都造成成千上萬(wàn)人死亡。流感病毒分為甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，甲型流感又包含15個(gè)血凝素(hemagglutinin，HA)亞型和9個(gè)神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)亞型，其中常引起人群發(fā)病的是甲型流感病毒中的H1N1和H3N2。 登革病毒(denguevirus，DV)感染是一種重要的蚊媒傳染病，主要流行于熱帶、亞熱

2、帶地區(qū)。DV包括4個(gè)不同血清型，即登革1、2、3、4型病毒(DV1～4型)。受登革病毒感染后初期癥狀可能類似一般感冒，少數(shù)病例會(huì)發(fā)展到嚴(yán)重可致死的登革出血熱(Denguehaemorrhagicfever,DHF)／登革休克綜合征(dengueshocksyndlone,DSS)。全球每年有大約0.8～1億登革熱和25～50萬(wàn)登革出血熱或登革休克綜合征患者。 乙型腦炎是由乙型腦炎病毒(Japaneseencephalitis，J

3、EV)引起，經(jīng)蚊蟲叮咬傳播的一種傳染性疾病，該病能引起嚴(yán)重的腦炎，往往會(huì)導(dǎo)致永久性大腦損傷，死亡率高。全球每年大概有16000例以上的乙型腦炎患者，約5000例的死亡報(bào)告，并且30％-50％的病愈患者會(huì)有不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。該病主要分布于亞洲地區(qū)。 黃熱病曾在南美洲、非洲等熱帶地區(qū)引起大范圍的流行，該疾病是由黃熱病毒(yellowfevervirus，YFV)引起，其臨床表現(xiàn)差別懸殊，輕型僅為自限性發(fā)熱，重型可發(fā)展至嚴(yán)重的

4、肝炎和出血熱。每年估計(jì)有200，000例黃熱病患者(30，000例死亡)。 上述傳染性病毒在感染早期通常臨床癥狀相似，難以實(shí)現(xiàn)早期臨床診斷，并且大多數(shù)的傳染性病毒感染目前尚無(wú)有效手段阻止或延緩病程發(fā)展，因此早期實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)對(duì)于迅速做出診斷，確立正確及時(shí)的治療方案、避免誤診、貽誤病程和控制疫情有重要意義。 目前針對(duì)病毒感染的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)往往依賴于病毒分離培養(yǎng)、核酸檢測(cè)(如PCR)和血清學(xué)檢測(cè)(如ELISA)等方法。多數(shù)病毒檢測(cè)

5、方法主要用于單一致病因子的鑒定，并且都存在不足之處?；蛐酒夹g(shù)代表著分子技術(shù)領(lǐng)域的最新發(fā)展，具有快速診斷和敏感的核酸分析能力。該技術(shù)在微生物分析、病原體檢測(cè)、基礎(chǔ)和應(yīng)用環(huán)境科學(xué)的監(jiān)控等方面都具有廣闊的應(yīng)用前景。 本研究首先運(yùn)用生物信息學(xué)軟件如BLAST、Oligo6.0、DNAClub，篩選出特異性高、長(zhǎng)度一致、Tm值相近的寡核苷酸探針，經(jīng)BLAST比對(duì)排除非特異性探針，分別針對(duì)H1N1、H3N2、DV1、DV2、DV3、DV

6、4、JEV和YFV設(shè)計(jì)并合成了62條寡核苷酸探針，用于點(diǎn)樣制備寡核苷酸芯片。采用K562細(xì)胞、乙型肝炎病毒質(zhì)粒、丙型肝炎病毒質(zhì)粒和丁型肝炎病毒質(zhì)粒作為陰性對(duì)照樣品。從省疾病預(yù)防控制中心取回的甲型流感H1N1、H3N2、DV1～4病毒株中提取的RNA樣品和克隆有JEV、YFV基因的質(zhì)粒樣品用于驗(yàn)證探針。采用限制性熒光標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行全基因組擴(kuò)增標(biāo)記，標(biāo)記產(chǎn)物純化后與芯片進(jìn)行雜交，并根據(jù)雜交結(jié)果篩選出與相應(yīng)病毒樣品的雜交信噪比高于2.5，且與其

7、它病毒樣品無(wú)非特異性雜交信號(hào)的寡核苷酸探針，得到22條高靈敏性、高特異性的寡核苷酸探針。 本課題通過(guò)實(shí)驗(yàn)室研究，得到以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.通過(guò)實(shí)驗(yàn)排除了非特異性雜交的探針以及存在空間位阻的探針，最終確定從62條探針中，選用了22條探針進(jìn)行臨床樣品驗(yàn)證。 2.優(yōu)化寡核苷酸芯片實(shí)驗(yàn)條件。結(jié)果表明，探針濃度調(diào)整為1μg/μL。雜交溫度42℃，雜交時(shí)間4h，雜交液含50％甲酰胺，10×SSC，0.2％SDS為寡核苷酸芯片最

8、適的實(shí)驗(yàn)條件。 3實(shí)驗(yàn)中新樣品加接頭后再次引入限制件酶切，該步驟能有效的去除可能的污染片段，而新加上接頭的樣品片段由于有甲基化保護(hù)，不會(huì)被酶切，從而可以避免實(shí)驗(yàn)過(guò)程中假陽(yáng)性結(jié)果的產(chǎn)生。 4.為了監(jiān)測(cè)芯片檢測(cè)的過(guò)程中是否存在人為的操作失誤以及降低芯片檢測(cè)的假陽(yáng)性率和假陰性率，研究中芯片陣列設(shè)計(jì)引入2條GFP寡核苷酸探針作為陽(yáng)性外對(duì)照，實(shí)驗(yàn)中將由重組載體上獲得的GFP基因的RNA、DNA片段和各病毒樣品混合后分別用限制性顯示

9、技術(shù)擴(kuò)增標(biāo)記，將標(biāo)記的樣品與芯片雜交，完成芯片的掃描及結(jié)果分析。結(jié)果表明，陣列設(shè)計(jì)中引入陽(yáng)性外對(duì)照探針能為基因芯片的檢測(cè)過(guò)程提供有效的質(zhì)控。 5.臨床樣品的檢驗(yàn)研究。研究中應(yīng)用寡核苷酸芯片對(duì)41例臨床樣品和疫苗株樣品(JEV、YFV)進(jìn)行了檢測(cè)。其方法是：從樣品中抽提出病毒RNA，與GFP基因的RNA樣品混合后，逆轉(zhuǎn)錄并用限制性顯示標(biāo)記技術(shù)使樣品標(biāo)上熒光物質(zhì)，與包含有實(shí)驗(yàn)中篩選出的22條高靈敏性、高特異性的寡核苷酸探針及2條GF

10、P陽(yáng)性外對(duì)照探針的芯片進(jìn)行雜交，芯片洗脫、掃描后采用GenePixPro6.0軟件進(jìn)行結(jié)果分析。同時(shí)實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)了多對(duì)引物，通過(guò)多重逆轉(zhuǎn)錄PCR臨床樣品進(jìn)行鑒定，并與芯片的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)照。雜交結(jié)果表明，芯片的特異性和靈敏度均較高，在這41例臨床樣品中，甲1型流感有6例，甲3型流感有2例，DV1有3例，DV2、DV3和DV4各1例，與多重逆轉(zhuǎn)錄PCR_的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。 綜上所述，研究中我們將限制性顯示PCR與基因芯片技術(shù)相結(jié)合，選