1、前言：
　　 近年來,胰島素類似物逐漸成為糖尿病治療的首選[1]。雖然通過DNA重組技術(shù)產(chǎn)生的胰島素類似物在分子結(jié)構(gòu)上有別于人類胰腺產(chǎn)生的胰島素,但其作用與人類胰島素相同。胰島素與類胰島素生長因子(IGF)分別與其特定的受體胰島素受體(IR)和類胰島素生長因子受體(IGF-IR)相結(jié)合并在細(xì)胞增殖方面發(fā)揮一定的作用[2-3]。通過刺激受體促進(jìn)生長增殖作用常常通過MAPK與PI3K-AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路介導(dǎo)來完成,該通路通過基因表達(dá)

2、調(diào)節(jié)來影響細(xì)胞的生長及分化。胰島素類似物的結(jié)構(gòu)修飾可改變其與胰島素受體或類胰島素生長因子受體的親和力,因此胰島素類似物可能增強(qiáng)細(xì)胞的促有絲分裂能力。目前有文獻(xiàn)報(bào)道大鼠乳腺細(xì)胞株B10Asp通過胰島素類似物的刺激后具有很強(qiáng)促有絲分裂能力,因此對(duì)糖尿病病人使用胰島素類似物治療的安全性引起了越來越多學(xué)者的重視[4-6]。很多學(xué)者對(duì)胰島素類似物刺激非致瘤性或癌癥細(xì)胞株[正常人乳腺上皮細(xì)胞株(MCF10與HMEC)[9],人乳腺癌細(xì)胞株(MCF-

3、7)[10],骨肉瘤細(xì)胞株(Saos/B10)。[11],肝細(xì)胞瘤細(xì)胞(HepG2)][12]后產(chǎn)生的促有絲分裂能力進(jìn)行了研究,然而卻得出了不同的結(jié)果。但這些結(jié)果卻是通過不同的實(shí)驗(yàn)方法,不同的實(shí)驗(yàn)條件以及不同的統(tǒng)計(jì)方法獲得。比如,有學(xué)者觀察到胰島素類似物可引起各種腫瘤細(xì)胞及人正常乳腺上皮細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力,但也有學(xué)者通過對(duì)各種細(xì)胞系進(jìn)行了相似的研究,并未發(fā)現(xiàn)明確不同。甲狀腺癌細(xì)胞對(duì)于胰島素以及類胰島素樣生長因了的反應(yīng)非常靈敏,同時(shí)常

4、常過度表達(dá)胰島素受體以及類胰島素生長因了受體。因此,胰島素類似物可能刺激甲狀腺癌細(xì)胞而導(dǎo)致細(xì)胞的加速增殖。另外,Shukla[8]報(bào)道對(duì)于高類胰島素生長因子受體/胰島素受體比率的細(xì)胞株來說,甘精胰島素對(duì)其具有強(qiáng)烈的促細(xì)胞分裂能力。通過文獻(xiàn)復(fù)習(xí),目前尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于胰島素類似物對(duì)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞株(IHH4)作用的影響相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 本篇文章的目的：
　　 1.檢測(cè)IHH4細(xì)胞株是否存在胰島素受體以及類胰島素生長因子受

5、體以及其相關(guān)比值。2.研究目前應(yīng)用于臨床的胰島素以及其類似物對(duì)IHH4細(xì)胞株的增殖影響.3研究在MAPK與PI3K-AKT通路中,胰島素及其類似物作用IHH4細(xì)胞株后對(duì)ERK1/2蛋白與AKT蛋白的影響。
　　 材料與方法：
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料
　　 1.細(xì)胞株
　　 甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞株IHH4有內(nèi)分泌研究所關(guān)海霞教授惠贈(zèng)。
　　 2.常規(guī)胰島素及胰島素類似物
　　 門冬胰島素insul

6、inaspart(B28Asphumaninsulin),
　　 賴脯胰島素insulinlispro(B28Lys,B29Pmhumaninsulin),
　　 甘精胰島素insulinglargine(A21Gly,B31Arg,B32Arghumaninsulin),
　　 地特胰島素insulindetemir(NN304)[B29Lys(-tetradecanoyl),desB30humaninsuli

7、n]
　　 優(yōu)泌樂Rhumaninsulinregular
　　 諾和靈Rhumaninsulinregular
　　 二、主要研究方法
　　 1、IHH4細(xì)胞株的培養(yǎng)。
　　 2、MTT法測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞是否存在促增殖作用。
　　 噻唑藍(lán)[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide,MTT](5mg/mL)染色法檢

8、測(cè)不同濃度的普通胰島素及胰島素類似物作用IHH4細(xì)胞株產(chǎn)牛的增殖作用。
　　 3、Westernblot檢測(cè)IR、IGF-IR、ERK1\2、pERK1\2、AKT、pAKT
　　 收集細(xì)胞提取總蛋白,BCA法檢測(cè)蛋白質(zhì)含量。進(jìn)行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)印至PVDF膜。封閉,IR、IGF-1R、ERK1\2、pERK1\2、AKT、pAKT一抗孵育過夜,相應(yīng)的二抗孵育,增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(enhancechemilumine

9、scence,ECL),拍照,以總ERK1\2及總AKT為內(nèi)參照,進(jìn)行條帶灰度值分析。
　　 4、計(jì)學(xué)分析
　　 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)結(jié)果以±s表示,以P＜0.05為判斷差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 1、IHH4細(xì)胞株類胰島素樣生長因子受體與胰島素受體的表達(dá)
　　 通過Westernblotting法對(duì)IHH4細(xì)胞株的類胰島素樣生長因子受體與胰島素受體進(jìn)行

10、蛋白水平的檢測(cè),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明IHH4同時(shí)表達(dá)類胰島素樣生長因子受體與胰島素受體,類胰島素樣生長因子受體與胰島素受體相比較后,前者含量輕度高于后者,該實(shí)驗(yàn)中測(cè)得的兩者的比值為1.36/1。
　　 2、胰島素與胰島素類似物對(duì)IHH4細(xì)胞株的增殖影響
　　 通過不同的濃度的普通胰島素及胰島素類似物(1.5nM,15nM和150nM)對(duì)IHH4細(xì)胞株進(jìn)行增殖測(cè)定實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):普通胰島素與胰島素類似物作用該細(xì)胞株48小時(shí)后,普通胰島素

11、、賴脯胰島素、地特胰島素、門冬胰島素與未處理組相比,對(duì)IHH4細(xì)胞株并無明顯增殖活性作用,而甘精胰島素對(duì)IHH4增殖活性作用略有增強(qiáng)。但經(jīng)過對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,并未發(fā)現(xiàn)藥物之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 3、胰島素與胰島素類似物對(duì)IHH4細(xì)胞株ERK1/2蛋白及AKT蛋白活化影響
　　 通過Westernblotting法對(duì)樣品中的ERK1/2蛋白與AKT蛋白以及其磷酸化形式pERK1/2蛋白與pAKT蛋白含量進(jìn)行檢測(cè),并以

12、樣品中的ERK1/2蛋白及PAKT蛋白作為內(nèi)參照,比較不同樣品通過不同刺激因素刺激后pERK1/2蛋白與pAKT蛋白含量的變化。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明在不同的濃度刺激下未處理組,胰島素類似物組及普通胰島素組中的磷酸化蛋白pERK1/2蛋白與pAKT蛋白含量并未發(fā)牛明顯的改變,統(tǒng)計(jì)學(xué)無明顯差異。推斷胰島素類似物并不能激活MAPK與PI3K-AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路。
　　 結(jié)論：
　　 1、IHH4細(xì)胞株表達(dá)胰島素受體及類胰島素生長因子