1、白癜風是一種以皮損處色素脫失為特征的慢性皮膚疾病，其發(fā)病機制目前尚不完全清楚。以往的研究發(fā)現白癜風發(fā)病機制與遺傳、自身免疫、氧化應激等因素有關，近年來氧化應激成為白癜風研究領域的一大熱點。多巴胺氧化是黑素細胞和多巴胺能神經細胞特有的氧化應激形式，多項研究證實多巴胺氧化可以影響多巴胺能神經元線粒體的正常形態(tài)和功能。線粒體是真核細胞中最重要的細胞器之一，是細胞有氧呼吸的主要場所，在細胞代謝和能量產生過程中扮演著重要角色。同時線粒體也是細胞內

2、氧自由基的最重要來源，更是活性氧的主要攻擊對象。線粒體的形態(tài)異常會加速氧自由基的產生，當線粒體受到氧化損傷不能代償時，會激活線粒體凋亡途徑誘導細胞凋亡。
　　多位學者從與多巴胺氧化相關的基因多態(tài)性、多巴胺氧化產物在皮損局部和全身的蓄積、多巴胺氧化對黑素細胞的影響等不同方面進行研究，提示多巴胺氧化與白癜風發(fā)病關系密切。本課題組的前期工作發(fā)現：白癜風患者血液循環(huán)中存在高滴度針對Mitofilin的自身抗體，Mitofilin是定位于線

3、粒體內膜的錨定蛋白，雖然Mitofilin的功能目前尚不完全清楚，但其在維持線粒體內膜和嵴的正常形態(tài)方面的關鍵性作用已為世人所公認。在HeLa細胞中特異性下調Mitofilin時，線粒體內膜重構，嵴形態(tài)消失，線粒體內活性氧增高，細胞凋亡增加。同時Mitofilin在修復mtDNA、維護線粒體內基因組穩(wěn)定方面扮演著重要的角色。新近的研究發(fā)現白癜風皮損區(qū)周圍的黑素細胞線粒體變得非常巨大，同時線粒體嵴的形態(tài)也發(fā)生了明顯的變化，進一步提示Mit

4、ofilin可能在白癜風發(fā)病中發(fā)揮了重要作用。
　　黑素細胞與多巴胺能神經元共同起源于外胚層神經嵴，并且都具有多巴胺代謝功能。我們推測多巴胺氧化條件下黑素細胞Mitofilin表達水平將下降，進而導致其線粒體結構和功能紊亂，產生更多的活性氧，導致細胞陷入氧化應激的惡性循環(huán)之中，最終激活包括線粒體途徑在內的多條凋亡通路，導致黑素細胞凋亡，這可能是白癜風中黑素細胞喪失的機制之一。
　　第一部分實驗：Mitofilin作為白癜風相

5、關抗原的確認
　　1.主要方法
　　提取黑素瘤細胞膜蛋白，利用白癜風自身抗體陽性血清和Mitofilin抗體分別與膜蛋白行免疫沉淀實驗，所得樣品再行Westernblot檢測線粒體內膜蛋白Mitofilin。
　　2.主要結果
　　Westernblot結果顯示在90kDa附近，白癜風血清組和Mitofilin抗體組均出現了陽性條帶。
　　3.主要結論
　　白癜風陽性血清中包含有針對Mitofilin

6、的自身抗體，提示Mitofilin在白癜風發(fā)病中起重要作用。
　　第二部分實驗：多巴胺對黑素細胞、Mitofilin及線粒體的影響
　　1.主要方法
　　300μM、500μM、1000μM多巴胺處理永生化的人表皮黑素細胞系PIG1，于處理后24h、24h及48h分別進行結晶紫染色、流式細胞術及Westernblot檢測黑素細胞增殖活性、凋亡及Mitofilin被抑制的情況。500μM多巴胺處理黑素細胞PIG1，24h

7、后利用JC-1染料檢測線粒體內膜電位變化。300μM多巴胺處理黑素細胞PIG1，72h后透射電鏡觀察細胞器變化。每次處理均設空白對照組和實驗組。
　　2.主要結果
　　多巴胺抑制黑素細胞增殖活性并誘導黑素細胞凋亡，與空白對照組相比具有統(tǒng)計學意義。多巴胺處理明顯降低黑素細胞Mitofilin蛋白及線粒體內膜電位水平。多巴胺處理使黑素細胞線粒體內膜、嵴明顯腫脹，內質網明顯腫脹，染色質邊集，凋亡小體形成。
　　3.主要結論<

8、br>　　多巴胺處理后，黑素細胞Mitofilin蛋白明顯下降，并因此導致線粒體形態(tài)和線粒體電位水平的異常，可能激活線粒體途徑誘導細胞凋亡。
　　第三部分實驗：多巴胺通過內質網應激及線粒體途徑誘導黑素細胞凋亡
　　1.主要方法
　　500μM多巴胺分別處理黑素細胞PIG11h、3h、6h、12h，Westernblot檢測GRP78、PKR、P-PKR、P-eIF2α、Caspase-3、Caspase-9、Bax、B

9、cl-2、β-actin等蛋白表達水平。
　　2.主要結果
　　在內參照β-actin不變的情況下，GRP78、P-PKR、P-eIF2α、Caspase-3、Caspase-9、Bax較對照組明顯升高，Bcl-2水平明顯降低，PKR水平未發(fā)生明顯變化。
　　3.主要結論
　　多巴胺激活內質網途徑及線粒體途徑誘導黑素細胞凋亡。
　　本研究首次證實白癜風患者體內存在高滴度針對Mitofilin的自身抗體；明確

10、Mitofilin為黑素細胞多巴胺氧化的靶蛋白之一；證實多巴胺通過下調Mitofilin影響黑素細胞線粒體的正常形態(tài)和功能，并激活內質網途徑和線粒體途徑誘導黑素細胞凋亡。
　　我們推測在白癜風中存在著一個惡性循環(huán)：黑素細胞中多巴胺或多巴醌代謝紊亂，產生過量的氧自由基，超出了機體自身抗氧化系統(tǒng)處理能力，抑制抗氧化系統(tǒng)功能，從而攻擊包括線粒體在內的生物膜系統(tǒng)，發(fā)生脂質過氧化作用，產生大量丙二醛類小分子。丙二醛等小分子與細胞蛋白質、DN

11、A等非特異性結合，影響細胞正常功能。同時，多巴醌也能直接與蛋白質結合，影響包括Mitofilin、SOD在內的蛋白質數量和功能，從而影響到線粒體的形態(tài)、功能和復制。異常的線粒體功能導致更大量氧自由基的產生，使細胞處于氧化應激的惡性循環(huán)之中，最終激活包括線粒體途徑在內的多條通路，導致細胞的壞死和凋亡。而細胞中蓄積的大量被變異調節(jié)的蛋白質如Mitofilin，釋放到細胞外，在局部炎癥因子的參與下，被抗原提呈細胞所識別，激活B細胞，最終產生了