1、研究背景和目的: 世界衛(wèi)生組織在《2007年全球衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)報(bào)告》中預(yù)測(cè)，到2030年缺血性心臟病將成為繼癌癥之后導(dǎo)致人類死亡的第二大疾病，而冠狀動(dòng)脈梗塞引起的心肌缺血是缺血性心臟病最重要的單因素致死原因。心臟是一個(gè)耗氧量很大的器官，且心肌不能進(jìn)行無(wú)氧代謝，所以，當(dāng)心肌缺血時(shí)，由于氧供給不能滿足氧需求，會(huì)引起心肌細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷，導(dǎo)致心肌舒縮功能障礙。因此，冠脈梗塞后及早再通閉塞的冠狀動(dòng)脈，有效恢復(fù)缺血心肌的血液灌注，是減少缺血性心肌損傷最有效

2、的方法。然而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床觀察均證明，血管再通本身能引起額外的心肌損傷，即再灌注損傷，直接影響病人的預(yù)后。因此，如何減輕缺血/再灌注損傷，最大限度地保護(hù)缺血心肌，是有效治療缺血性心臟病的關(guān)鍵。 一、后處理對(duì)缺血/再灌注心肌組織HIF-1α表達(dá)的影響。 目的: 1、觀察后處理對(duì)缺血/再灌注心肌組織HIF-1α表達(dá)的影響； 2、分析HIF-1α表達(dá)水平與再灌注心肌損傷之間可能存在的關(guān)系。 方法：

3、 1、選取成年Wistar大鼠30只，隨機(jī)分為以下3組； (1)偽手術(shù)組(Sham，n=10)； (2)缺血/再灌注組(Control，n=10)； (3)缺血后處理組(PostC，n=10)。 2、心肌梗死面積測(cè)定：采用Evansblue和TTC雙染法，正常的心肌組織被染成藍(lán)色，缺血但未梗死的心肌組織被染為紅色，梗死的心肌組織為白色。圖像分析測(cè)定各區(qū)域面積。危險(xiǎn)區(qū)面積(AAR/LV，％)=(危險(xiǎn)區(qū)總面

4、積/左心室面積)×100％心梗面積(An/AAR，％)=(梗死區(qū)面積/危險(xiǎn)區(qū)總面積)×100％ 3、測(cè)定血清肌酸激酶(CK)的活性來(lái)進(jìn)一步反映心肌損傷情況； 4、分別采用原位末端標(biāo)記法(TUNEL)和Caspase-3活性測(cè)定法檢測(cè)大鼠心肌組織中心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生情況； 5、用Western—blot法檢測(cè)大鼠心肌組織中HIF-1α與iNOS的蛋白表達(dá)水平； 6、用免疫組化法測(cè)定心肌組織中HIF-1α的定位

5、及表達(dá)； 7、用real—TimePCR法檢測(cè)大鼠心肌組織中HIF-1α與iNOSmRNA的表達(dá)水平。 小結(jié)： 1、與缺血/再灌注相比，后處理使心肌組織中HIF-1α蛋白水平顯著上調(diào)； 2、后處理減輕心肌缺血/再灌注損傷可能與其上調(diào)HIF-1α表達(dá)有關(guān)。 二、HIF-1α表達(dá)改變可以影響后處理對(duì)缺血心肌的保護(hù)效應(yīng)。 目的: 1、采用藥理學(xué)方法(DMOG，脯氨酸羥化酶的抑制劑)使心肌

6、組織中HIF-1α表達(dá)上調(diào)，觀察其對(duì)后處理減輕心肌缺血/再灌注損傷的影響； 2、模擬心肌缺血/再灌注，在培養(yǎng)的心肌細(xì)胞上制備缺氧/復(fù)氧及缺氧后處理模型，然后利用RNAi技術(shù)使心肌細(xì)胞的HIF-1α基因沉默，觀察后處理對(duì)缺氧/復(fù)氧所致心肌細(xì)胞損傷的影響。 方法: 1、選取成年Wistar大鼠40只，隨機(jī)平均分為以下4組； (1)缺血/再灌注組(Control，n=10)； (2)DMOG+缺血/再灌

7、注組(DMOG+Control，n=10)； (3)生理鹽水+后處理組(Vehicle+PostC，n=10)； (4)DMOG+后處理組(DMOG+PostC，n=10)。 2、心肌梗死面積測(cè)定：采用Evanseblue和TTC雙染法測(cè)定缺血/再灌注所致的心肌梗死面積； 3、測(cè)定血清肌酸激酶(CK)的活性來(lái)進(jìn)一步反映心肌損傷情況； 4、采用Caspase-3活性測(cè)定法反映大鼠心肌組織中心肌細(xì)胞凋

8、亡發(fā)生情況； 5、用Western—blot法檢測(cè)大鼠心肌組織中HIF-1α及iNOS的蛋白表達(dá)水平； 6、用real—TimePCR法檢測(cè)大鼠心肌組織中HIF-1α及iNOSmRNA的表達(dá)水平； 7、采用放射免疫法檢測(cè)各組大鼠心肌組織中cGMP含量； 8、利用培養(yǎng)的H9c2心肌細(xì)胞模擬心肌缺血/再灌注建立缺氧/復(fù)氧及缺氧后處理模型： (1)常氧對(duì)照組：置于37℃95％空氣，5％CO2中持續(xù)培養(yǎng)5

9、h； (2)缺氧/復(fù)氧組：置于充滿95％N2和5％CO2的三氣培養(yǎng)箱內(nèi)缺氧培養(yǎng)3h，然后再轉(zhuǎn)入充滿95％空氣，5％CO2的常氧培養(yǎng)箱中復(fù)氧2h； (3)缺氧后處理組：缺氧培養(yǎng)3h后，復(fù)氧5min+缺氧5min，重復(fù)三次，然后再?gòu)?fù)氧培養(yǎng)1.5h； (4)DMOG+缺氧后處理：缺氧前在培養(yǎng)液中分別加入不同量的DMOG，使其終濃度分別為0.1mM，0.5mM以及1mM，其余操作同(3)； 9、檢測(cè)心肌細(xì)胞存活率

10、(CCK8法)，培養(yǎng)液上清中乳酸脫氫酶(LDH)活性變化以及caspase-3活性來(lái)反映缺氧/復(fù)氧及缺氧后處理對(duì)心肌細(xì)胞的影響； 10、利用RNAi技術(shù)使培養(yǎng)的心肌細(xì)胞HIF-1α基因沉默。 小結(jié)： 1、DMOG使心肌組織中HIF-1α蛋白水平上調(diào)，其上調(diào)程度同后處理的效應(yīng)相同，而給予DMOG后再進(jìn)行后處理，則可更進(jìn)一步增加HIF-1α的蛋白表達(dá)，提示DMOG與后處理在增加HIF-1α表達(dá)方面具有疊加效應(yīng)。給予D

11、MOG并不影響HIF-1αmRNA的表達(dá)，說(shuō)明其是在翻譯后水平上對(duì)HIF-1α進(jìn)行調(diào)節(jié)； 2、DMOG通過(guò)上調(diào)HIF-1α蛋白水平減輕了缺血/再灌注導(dǎo)致的心肌損傷，而且更進(jìn)一步增強(qiáng)了后處理的保護(hù)效應(yīng)，表現(xiàn)出DMOG與后處理的疊加效應(yīng)，進(jìn)一步提示HIF-1α表達(dá)上調(diào)與后處理的心肌保護(hù)機(jī)制可能存在著一定的聯(lián)系； 3、DMOG上調(diào)心肌組織HIF-1α表達(dá)，以及增強(qiáng)后處理保護(hù)效應(yīng)的同時(shí)，心肌組織iNOS表達(dá)與cGMP含量均發(fā)生相

12、應(yīng)的增加，提示HIF-1α可能通過(guò)其下游iNOS—cGMP通路參與后處理的保護(hù)機(jī)制； 4、HIF-1α基因沉默后，削弱了后處理對(duì)缺氧/復(fù)氧所致心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)效應(yīng)。 三、后處理可以減輕高脂血癥大鼠心肌缺血/再灌注損傷。 目的： 1、建立食源性高脂血癥大鼠模型，觀察高脂血癥對(duì)心肌缺血/再灌注損傷是否具有影響； 2、觀察后處理是否可以影響高脂血癥大鼠缺血/再灌注所致的心肌損傷； 3、觀察高脂

13、血癥對(duì)心肌組織中HIF-1α表達(dá)的影響。 方法: 1、選取成年Wistar大鼠60只，體重120±10g，隨機(jī)平均分為以下兩大組； (1)正常飲食組(N=30)：普通飼料喂養(yǎng)8周，分別隨機(jī)分為以下3組：①正常飲食—偽手術(shù)組(N—Sham，n=10)；②正常飲食—缺血/再灌注組(N—Control，n=10)；③正常飲食—缺血后處理組(N-PostC，n=10)。 (2)高脂血癥組(N=30)：高脂飼料喂養(yǎng)

14、8周后鼠尾采血測(cè)定血脂水平，隨機(jī)平均分為以下3組：①高脂血癥—偽手術(shù)組(HC—Sham，n=10)；②高脂血癥一缺血/再灌注組(HC—Control，n=10)；③高脂血癥—缺血后處理組(HC-PostC，n=10)。 2、采用比色法測(cè)定血脂水平； 3、心肌梗死面積測(cè)定：采用Evanseblue和TTC雙染法測(cè)定心肌梗死面積； 4、測(cè)定血清肌酸激酶(CK)的活性來(lái)進(jìn)一步反映心肌損傷情況； 5、采用Casp

15、ase-3活性測(cè)定法反映大鼠心肌組織中心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生情況； 6、用Western—blot法檢測(cè)大鼠心肌組織中HIF-1α及iNOS的蛋白表達(dá)水平； 7、用real—TimePCR法檢測(cè)大鼠心肌組織中HIF-1α及iNOSmRNA的表達(dá)水平。 小結(jié)： 1、后處理可以減輕高脂血癥大鼠缺血/再灌注造成的心肌損傷； 2、高脂血癥及后處理均可上調(diào)心肌組織中HIF-1α的蛋白水平，后處理減輕高脂血癥大鼠心