1、目的：
　　1.探索脂質(zhì)微泡搭載氫氣以制作氫氣微泡的可行性;
　　2.探索氫氣微泡治療心肌缺血再灌注損傷的可能性及其機制。
　　材料和方法：
　　1.實驗材料
　　實驗儀器與試劑:制作脂質(zhì)微泡的磷脂材料DSPC、DSPE-PEG2000購自美國Avanti公司，安全無菌，組織相容性好。全氟丙烷氣體購自天津核工業(yè)理化工程研究院;氫氣購自深圳市深特工業(yè)氣體有限公司，純度達99％以上;氫氣微電極系統(tǒng)購自丹麥Uni

2、sense公司，此系統(tǒng)由化學系統(tǒng)、信號處理系統(tǒng)和微操作系統(tǒng)三部分組成?；瘜W系統(tǒng)即是氫氣微電極，信號處理系統(tǒng)包括信號交換器和皮安表。其工作原理為氫氣經(jīng)擴散作用經(jīng)過氫氣微電極的硅膜后，在傳感器的鉑陽極處氧化產(chǎn)生電子流。在傳感器電子流從氧化的陽極流向內(nèi)部的參比，同時皮安表獲得線性的氫氣分壓信號。此系統(tǒng)在水中檢測氫氣的極限濃度為0.3μM; VEVO2100小動物超聲成像儀購自VisualSonics公司，應用與其配套的MS-250超聲探頭（中

3、心頻率21MHz，寬帶頻率13MHz～24 MHz，分辨率達到75微米，實時幀頻大于500fps），在M-MODE模式下測量大鼠的左室射血分數(shù)和短軸縮短分數(shù)。
　　實驗動物: SD雄性大鼠購自廣東省實驗動物中心，體重250～300克，飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境中。
　　2.實驗方法
　　2.1 氫氣微泡的制備與表征
　　DSPC、DSPE-PEG2000以摩爾比9∶1，利用薄膜震蕩法制作氟氫比(C3F8/H2)為3∶0、

4、1∶1和0∶3的脂質(zhì)微泡。測量比較不同微泡的粒徑、濃度和含氫量，并在顯微鏡下觀察微泡的形態(tài)。挑選出含氧量高、粒徑和濃度均適宜的微泡做后續(xù)實驗。
　　利用氫氣微電極系統(tǒng)檢測氫氣微泡在體外PBS溶液中和大鼠左心室腔內(nèi)隨時間的釋氫曲線。
　　將濃度為5×105、5×106、5×107、5×108、5×109/ml的氫氣微泡裝入橡膠袋中，應用VEVO2100超聲成像儀對其進行超聲成像，并測量每種微泡的視屏強度信號。將2×1010個氫

5、氣微泡經(jīng)尾靜脈注入大鼠體內(nèi)，應用VEVO2100超聲成像儀檢測左心室造影成像的效果，并繪制時間-視頻強度曲線。
　　2.2 動物模型的制備及分組
　　取成年雄性SD大鼠麻醉后切斷左側第3或第4根肋骨，暴露心臟結扎左冠狀動脈形成心肌缺血，30分鐘后松開結扎線形成再灌注。
　　所有大鼠隨機分為三組:
　?、偌偈中g組，只進行開胸手術，不進行缺血操作;
　?、谄胀ㄎ⑴萁M，再灌注前5分鐘經(jīng)尾靜脈注入一定量未載氫氣的普

6、通微泡;
　　③氫氣微泡組，再灌注前分鐘經(jīng)尾靜脈注入一定量氫氣微泡。
　　為研究心肌梗死面積與氫氣微泡劑量的關系，在②、③組中另設高劑量組和低劑量組。高劑量，每只大鼠注入2×1010個微泡;低劑量，每只大鼠注入4×109個微泡。
　　2.3 缺血區(qū)及梗死區(qū)面積的測量
　　再灌注24小時后開胸拉緊結扎線形成與之前相同的心肌缺血，經(jīng)尾靜脈注入伊文思藍染液以區(qū)分缺血區(qū)與非缺血區(qū)。迅速處死大鼠后取心臟沿短軸位做切片，進行

7、TTC染色，以區(qū)分梗死區(qū)與非梗死區(qū)。測量梗死區(qū)的面積(INF)、缺血區(qū)面積(AAR)和左心室的面積(LV)，并計算AAR/LV、INF/AAR及INF/LV。
　　2.4 超聲心動圖測定大鼠心肌功能
　　再灌注24小時后，用VEVO2100小動物超聲成像儀測量各組大鼠的左室射血分數(shù)和短軸縮短分數(shù)，以評價各組大鼠的心功能。
　　2.5 H&E染色觀察各組大鼠的心肌結構變化
　　再灌注24小時后，取大鼠心臟做石蠟切片

8、，進行H&E染色，顯微鏡下觀察各組大鼠的心肌結構。
　　2.6 TUNEL檢測心肌細胞凋亡
　　再灌注24小時后，取大鼠心臟做石蠟切片，利用TUNEL法檢測各組大鼠心肌細胞的凋亡。
　　2.7 炎性因子TNF-α，IL-1β的檢測
　　再灌注24小時后，取大鼠心臟作組織勻漿，ELISA法檢測各組大鼠心肌組織中炎性因子TNF-α，IL-1β的含量。
　　2.8 活性氧H2O2、NO·、·OH及O2-·的檢測<

9、br>　　再灌注40分鐘后，取大鼠心臟作組織勻漿，迅速與CM-H2DCFDA、DAF-2DA、HPF及MitoSOX指示劑反應，酶標儀測定各自的熒光強度以計算各自的濃度。
　　2.9 毒性實驗
　　取健康SD大鼠3只，注射氫氣微泡前經(jīng)尾靜脈抽取大鼠血液100μl，注射氫氣微泡后第3、7天再分別取血液100μl。用全自動血細胞分析儀對大鼠血液樣品進行分析。第7天取完血液后，離頸處死并取大鼠的心、肝、脾、肺、腎做石蠟切片，行H&

10、E染色，觀察其結構改變。并用3只未注射氫氣微泡的健康大鼠作對照。
　　2.10 統(tǒng)計方法
　　所有結果以均值±標準差表示，心肌梗死面積、左心室功能的比較采用兩獨立樣本t檢驗，心肌細胞凋亡、炎癥因子、活性氧的比較采用One-way ANOVA分析，組間多重比較用Bonferroni法。所有統(tǒng)計分析均采用SPSS13.0軟件，并以P＜0.05作為顯著性檢驗標準。
　　結果：
　　1.成功制得不同C3F8/H2的氫氣微

11、泡，其中C3F8/H2為1∶1的氫氣微泡的含氫量最高，達(1.46±0.08)μmol/ml，微泡的平均粒徑為(0.89±0.03)μm，濃度為(2.29±0.07)×1010/ml。光鏡下微泡呈中心透亮的球形，大小較均勻。
　　2.氫氣微泡在體外PBS溶液及體內(nèi)左心室腔內(nèi)均能自發(fā)釋放氫氣。
　　3.氫氣微泡在體外、體內(nèi)均能實現(xiàn)超聲增強造影成像。
　　4.與普通微泡組相比，氫氣微泡組大鼠心肌梗死而積顯著減小(P＜0.0

12、5)。高劑量的氫氣微泡與低劑量相比，其心肌梗死面積更小(P＜0.01)，對心肌的保護作用更顯著。
　　5.與普通微泡組相比，氫氣微泡組的心肌細胞凋亡數(shù)顯著減小，顯微鏡下氫氣微泡組大鼠的心肌結構明顯好于普通微泡組。同時，氫氣微泡組EF、FS均明顯高于普通微泡組(P＜0.05)，說明氫氣微泡能保護缺血再灌注損傷后的心肌功能。
　　6.與普通微泡組相比，氫氣微泡組大鼠心肌組織中炎性因子TNF-α、IL-1β的含量明顯減低，說明氫氣

13、微泡能顯著緩解心肌的炎癥反應。
　　7.與普通微泡組相比，氫氣微泡組大鼠心肌組織中·OH含量顯著降低，而H2O2、 NO·及O2-·含量未見明顯差異。
　　8.注射氫氣微泡前及注射后3、7天大鼠的血常規(guī)檢查各項指標均在正常值范圍內(nèi)。大鼠的心、肝、脾、肺、腎等主要內(nèi)臟器官組織結構未見明顯異常改變。
　　結論：
　　1.脂質(zhì)微泡可以包裹氫氣，是一種理想的氫氣載體。
　　2.氫氣微泡可顯著減少心肌缺血再灌注后心肌