1、研究背景:
　　 定心方是南方醫(yī)科大學(xué)賈鈺華教授的經(jīng)驗(yàn)方,經(jīng)過長(zhǎng)期的臨床和實(shí)驗(yàn)研究被證實(shí)不僅可以有效地防治快速型心律失常而且還可以減輕心肌缺血再灌注損傷[1-1]。前期國(guó)家自然基金“心肌缺血及再灌注心律失常的蛋白組基礎(chǔ)與定心方作用機(jī)制”的研究通過凝膠雙向電泳和質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)抗增殖蛋白(prohibitins)是定心方的一個(gè)作用靶點(diǎn)[5],但其在心肌缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制尚未明確。
　　 第一章:抗增殖蛋白參與定心方減輕

2、大鼠心肌缺血再灌注損傷的初步機(jī)制
　　 目的:
　　 1.研究抗增殖蛋白在心肌缺血再灌注損傷中的表達(dá)及定心方的影響。
　　 2.研究定心方在心肌缺血再灌注中對(duì)MAPK通路的激活作用。
　　 3.探討抗增殖蛋白參與定心方減輕心肌缺血再灌注損傷過程中與MAPK通路的關(guān)系。
　　 方法:
　　 1.實(shí)驗(yàn)分組:40只SPF級(jí)雄性wistar大鼠,體重200-250g,隨機(jī)分為假手術(shù)組,心肌缺血再灌

3、注模型組,定心方高、中、低劑量組共5組,每組8只。
　　 2.實(shí)驗(yàn)處理:定心方高、中、低劑量組分別給予37.5g·kg-1·d-1、18.75g·kg-1·d-1、9.375g·kg-1·d-1的藥量,每日分為兩次給藥,連續(xù)灌胃7天；假手術(shù)組和模型組灌服生理鹽水。末次給藥前12h禁食不限水,在末次給藥2h后除假手術(shù)組大鼠外均造模,結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支中上1/3處15min,再灌注30min。
　　 3.檢測(cè)指標(biāo):術(shù)中記錄

4、大鼠再灌注時(shí)段Ⅱ?qū)?lián)心電圖,進(jìn)行心律失常評(píng)分。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)分離左室心肌,提取蛋白,應(yīng)用western blotting法檢測(cè)prohibitin、pP38、pJNK、pERK1/2蛋白表達(dá),以GAPDH為內(nèi)參蛋白,測(cè)量累積光密度。
　　 4.統(tǒng)計(jì)方法:心律失常評(píng)分屬于等級(jí)資料,多組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)多個(gè)樣本的Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)法進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均秩(R)表示。蛋白質(zhì)表達(dá)累積光密度(IOD)的比值多組間比較

5、應(yīng)用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn),組間多重比較應(yīng)用Bonferroni法,數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示?？乖鲋车鞍着cMAPK通路中3個(gè)蛋白分別進(jìn)行兩兩相關(guān)性分析,同時(shí)控制通路中其他兩個(gè)蛋白對(duì)這種相關(guān)關(guān)系的影響作為控制變量。
　　 結(jié)論:
　　 1.定心方通過抑制抗增殖蛋白的應(yīng)激性增高減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷。
　　 2.定心方通過激活抗凋亡通路ERK1/2,同時(shí)減少促凋亡通路P38、JNK通路

6、的激活減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷。
　　 3.抗增殖蛋白可能是通過P38、JNK通路參與定心方減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷。
　　 第二章 體外實(shí)驗(yàn)平臺(tái)建立
　　 第一節(jié) 定心方含藥血清制備及優(yōu)化
　　 目的:
　　 篩選定心方含藥血清抗氧化應(yīng)激損傷的最優(yōu)制備方法
　　 方法:
　　 48只雄性wistar大鼠,體重200-250g,隨機(jī)分為4組,每組12只,分別灌服不同劑量定心方水

7、煎劑,給藥劑量分別為18.75 g·kg-1·d-1、37.5g·g·kg-1·d-1、75 g·kg-1·d-1、150 g·kg-1·d-1,每日藥量分兩次灌胃,連續(xù)給藥七天。末次給藥前12h禁食不禁水,每組分別在末次灌藥后30、60、90、120 min各取3只大鼠腹主動(dòng)脈采血,分離血清,0.22 μ m微孔濾膜過濾除菌,56℃滅活30min,每只大鼠血清單獨(dú)分裝,-20℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 用Wistar乳鼠制備原代心肌細(xì)

8、胞,接種于96孔培養(yǎng)板,每孔接種1×104個(gè)細(xì)胞。每只大鼠含藥血清對(duì)應(yīng)一個(gè)培養(yǎng)孔,即按藥物濃度和采血時(shí)間分組,每組3孔,共16組。含藥血清培養(yǎng)24h后,吸除原培養(yǎng)基,加入含H2O2濃度為200 μ m/L的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3h。干預(yù)完成后,進(jìn)行MTT試驗(yàn),測(cè)量OD值。
　　 OD值屬計(jì)量資料,經(jīng)單樣本K-S擬和優(yōu)度檢驗(yàn)(1-Sample K-S Test)符合正態(tài)分布,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示。本實(shí)

9、驗(yàn)是2因素4水平的設(shè)計(jì),應(yīng)用析因設(shè)計(jì)的方差分析法分析其交互效應(yīng)及主效應(yīng),主效應(yīng)間多重比較應(yīng)用Bonferroni法；單獨(dú)效應(yīng)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。
　　 結(jié)論:定心方含藥血清抗氧化應(yīng)激損傷時(shí)大鼠的給藥劑量是75 g·kg-1·-1,采血時(shí)間點(diǎn)是90min藥效最佳。
　　 第二節(jié) 定心方含藥血清成分分析
　　 目的:
　　 檢測(cè)定心方含藥血清中部分成分含量
　　 方法:<

10、br>　　 10只wistar雄性大鼠,隨機(jī)分為兩組,每組5只。定心方組根據(jù)前節(jié)篩選的定心方含藥血清制備方法,選擇定心方劑量為75 g·kg-1·d-1,末次給藥前12h禁食不禁水,末次給藥90min后采血,分離血清,每只大鼠的血清單獨(dú)分裝?？瞻讓?duì)照組灌服等體積生理鹽水。
　　 每個(gè)樣品取血清2ml,加入乙腈16ml,在渦旋器上震蕩5min,3000r/min離心20min取上清液,40℃恒溫,氮?dú)獯蹈?加入甲醇1ml于渦旋混

11、合器上溶解,0.22 u m微孔濾膜過濾,即得樣品溶液。篩選高效液相色譜質(zhì)譜條件,考察方法的精密度、線性關(guān)系、穩(wěn)定性、回收率,測(cè)定定心方含藥血清鹽酸小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、丹參酮ⅡA、氧化苦參堿的含量。
　　 結(jié)果和結(jié)論:定心方含藥血清中成分明確的物質(zhì)及濃度是鹽酸小檗堿1.4141±0.0224 μg/ml,鹽酸巴馬汀0.3883±0.0082 μg/ml,鹽酸黃連堿0.4889±0.0156μg/ml,氧化苦參堿0.4

12、663±0.0129 μg/ml,丹參酮Ⅱ A未檢出。
　　 第三節(jié) siRNA轉(zhuǎn)染原代心肌細(xì)胞濃度的篩選
　　 目的:
　　 篩選脂質(zhì)體介導(dǎo)化學(xué)合成siRNA轉(zhuǎn)染原代心肌細(xì)胞的理想濃度
　　 方法:
　　 當(dāng)心肌細(xì)胞融合至80％搏動(dòng)良好時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1-2小時(shí),用0.1％胰蛋白酶消化細(xì)胞3-5分鐘。重懸細(xì)胞,調(diào)整濃度至1×105/ml。細(xì)胞懸液接種至六孔板每孔2ml。應(yīng)用siPORTM Ne

13、oFXTM脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑,分別轉(zhuǎn)染濃度為0,5,10,20,30nM Cy3-Negative siRNA分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染24h后,應(yīng)用熒光顯微鏡觀察,及采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行轉(zhuǎn)染效率及凋亡率檢測(cè),每項(xiàng)每組應(yīng)用三個(gè)孔。
　　 根據(jù)篩選的最佳濃度將PHB siRNA ID s129542(5’-3’GCUUUUAUUGUUACACUUtt)和PHB siRNA ID s217968(5’-3’ACUGUGAAAUUUAAUGAUUtt)稀

14、釋液等量混勻,進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染含有設(shè)置空白對(duì)照組,每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染48h后,提取蛋白進(jìn)行western blotting檢測(cè)。
　　 siRNA轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞凋亡率應(yīng)完全隨機(jī)設(shè)計(jì)多個(gè)樣本比較應(yīng)用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)法進(jìn)行分析,多重比較應(yīng)用Bonferroni法。westernblotting檢測(cè)的光密度比值兩組間比較應(yīng)用兩個(gè)獨(dú)立樣本的秩和檢驗(yàn)采用Mann-Whithey Test檢驗(yàn)法。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)

15、差(-x±s)表示。
　　 結(jié)論:siRNA可以通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑siPORTM NeoFXTTM介導(dǎo)進(jìn)入原代大鼠心肌細(xì)胞內(nèi),其適宜濃度為30nM。
　　 第三章 抗增殖蛋白參與定心方減輕心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的初步機(jī)制
　　 目的:
　　 1.研究抗增殖蛋白在心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的表達(dá)及定心方的影響。
　　 2.研究定心方在心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中對(duì)MAPK通路的激活作用。
　　 3.探討

16、抗增殖蛋白參與定心方減輕心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損過程中與MAPK通路的關(guān)系。
　　 方法:
　　 實(shí)驗(yàn)共分為7個(gè)組:1.正常組(Normal),2.模型組(H2O2),3.定心方組(H2O2+DXF),4.PHBsiRNA干擾組(H2O2+PHBsiRNA),5.ERK阻斷劑組(H2O2+U0126),6.JNK阻斷劑組(H2O2+SP600125),7.P38阻斷劑組(H2O2+SB203580)。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔,分別用于細(xì)

17、胞凋亡檢測(cè)與提取蛋白,每項(xiàng)各用3孔。siRNA轉(zhuǎn)染24h后,更換培養(yǎng)基,定心方含藥血清干預(yù)各組DMEM培養(yǎng)基含12.5％含藥大鼠血清,其余各組培養(yǎng)基含12.5％空白對(duì)照大鼠血清。阻斷ERK、JNK、P38通路各組在46h分別加入相應(yīng)的阻斷劑U012610、SP600125、SB203580使其在培養(yǎng)基中的濃度對(duì)應(yīng)為10 μM、25 μM、5 μM。轉(zhuǎn)染48h后,用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)清洗培養(yǎng)板,最終加入和H2O2濃度為200 μM的培養(yǎng)

18、基繼續(xù)培養(yǎng)3h。
　　 細(xì)胞凋亡率和蛋白質(zhì)免疫印跡測(cè)量值累積光密度(IOD)與內(nèi)參的比值,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示；多組間比較應(yīng)用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)多個(gè)樣本比較的Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)法進(jìn)行分析,組間多重比較應(yīng)用Bonferroni法。抗增殖蛋白與MAPK通路中3個(gè)蛋白分別進(jìn)行兩兩相關(guān)性分析,同時(shí)控制通路中其他兩個(gè)蛋白對(duì)這種相關(guān)關(guān)系的影響作為控制變量,采用偏相關(guān)分析。
　　 結(jié)論: