1、溫度是限制植物地理分布和生長(zhǎng)發(fā)育的主要因素之一，低溫會(huì)給植物的產(chǎn)量造成巨大的損失。榛子是重要的落葉木本植物，具有極大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)效益，而且與其他木本植物相比具有基因組小、結(jié)果早、易于研究的優(yōu)勢(shì)，可以作為研究樺木科乃至殼斗目植物代謝過程的模式物種；世界上廣泛種植的是歐洲榛，具有果大皮薄等優(yōu)點(diǎn)但不抗寒，在我國廣泛分布的平榛能耐受-48℃的低溫，但目前為止公共數(shù)據(jù)庫中還沒有榛子抗寒相關(guān)的分子生物學(xué)信息，本研究以寒冬時(shí)期的平榛花芽為試材，采

2、用Solexa高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，從中篩選出大量的冷調(diào)節(jié)基因，采用RT-PCR技術(shù)研究了20個(gè)基因?qū)Σ煌蜏貤l件的表達(dá)差異，并選擇轉(zhuǎn)錄因子CBF和功能基因脫水素基因進(jìn)行初步的功能分析，結(jié)果將為以后的榛子抗寒遺傳改良提供基因資源，也為進(jìn)一步了解榛子越冬分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　1.利用平榛寒冬時(shí)期的花芽為材料建立cDNA文庫，接著在Illumina上采用Solexa技術(shù)進(jìn)行序列測(cè)定，總共進(jìn)行了13,815,

3、180次讀數(shù)，共獲得有效序列2,030,831,460 nt。序列經(jīng)組裝得到129,912個(gè)Contig，53,471個(gè)獨(dú)立的Singleton，進(jìn)一步拼接后，共獲得43,285個(gè)Unigene。按照GO的分子功能、生物過程和細(xì)胞組分等3個(gè)不同分類角度對(duì)被注釋的3,890個(gè)具有同源性匹配的基因序列進(jìn)行分類。在具有功能注釋的43,285個(gè)Unigene中，通過進(jìn)一步 Blastn比對(duì)，根據(jù)“基因結(jié)構(gòu)相似，功能同源”的原理，在平榛花芽轉(zhuǎn)錄組

4、文庫中篩選到幾十條冷調(diào)節(jié)相關(guān)的Unigene，分別涉及轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗性、細(xì)胞壁代謝、碳代謝、氮代謝、脂肪酸代謝、多胺代謝、滲調(diào)物質(zhì)等功能類別，對(duì)其中20個(gè)假定的冷調(diào)節(jié)基因（包括14-3-3、HSP22、GPAT、WCOR413-PM、ADF、bzip78、ICE、CIP、NAC、PHD、ENO、HD、DOF、SPDS、NIR、BADH、BAM、ERD7、KT、SATO）進(jìn)行全長(zhǎng)克隆并設(shè)計(jì)引物采用熒光定量PCR手段對(duì)越冬過程中的四個(gè)時(shí)

5、間點(diǎn)進(jìn)行了表達(dá)分析，2個(gè)基因在冷適應(yīng)時(shí)期（CA）表達(dá)量最大，18個(gè)基因在寒冬時(shí)期（MW）出現(xiàn)最大表達(dá)豐度；采用半定量RT-PCR方法研究了20個(gè)基因?qū)Φ蜏孛{迫的響應(yīng)，轉(zhuǎn)錄因子一般出現(xiàn)在低溫脅迫后的2-4h之內(nèi)，功能基因?qū)Φ蜏氐捻憫?yīng)較慢；另外采用半定量RT-PCR方法還研究了20個(gè)基因在冷適應(yīng)時(shí)期兩種榛屬植物平榛和歐洲榛中的表達(dá)差異，大部分基因在平榛中表達(dá)強(qiáng)度比歐洲榛高。
　　2.適當(dāng)?shù)膬?nèi)參基因選擇是進(jìn)行基因表達(dá)研究的前提，本研究采

6、用半定量RT-PCR方法對(duì)ChACTIN、ChMDH、ChUBQ和ChEF1α四個(gè)內(nèi)參基因在冷脅迫條件下和不同器官中的表達(dá)進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ChACTIN是最穩(wěn)定的。
　　3.從平榛花芽轉(zhuǎn)錄組文庫中篩選得到兩個(gè)CBF基因：CBF1和CBF2，CBF1的最大表達(dá)量出現(xiàn)在寒冬時(shí)期，CBF2最大表達(dá)量出現(xiàn)在冷適應(yīng)時(shí)期，推測(cè)兩者分別主要參與平榛的抗凍和抗冷，共同完成平榛的越冬過程；CBF1和CBF2分別在4℃處理后8h和4h轉(zhuǎn)錄本累積量

7、最大；空間表達(dá)結(jié)果表明CBF1主要在雄花序中表達(dá)，CBF2主要在花芽中表達(dá)。CBF2在兩種生態(tài)型的榛屬植物中存在序列多態(tài)性，這種氨基酸的突變可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄結(jié)合活性的差異。同時(shí)pBI121-CBF2-GFP融合蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)也驗(yàn)證了CBF2的核定位功能。
　　4.通過RACE技術(shù)獲得兩個(gè)DHN基因的全長(zhǎng)序列，DHN1包含一個(gè)長(zhǎng)度為339 bp的開放讀碼框，編碼一個(gè)含112個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，5'非翻譯區(qū)長(zhǎng)60 bp，3'非

8、翻譯區(qū)長(zhǎng)98 bp，屬于K2S類型DHN，在DHN1基因的3’非編碼區(qū)域含有97bp的內(nèi)含子，Genebank注冊(cè)號(hào)：HM228388；DHN2包含一個(gè)長(zhǎng)度為504bp的開放讀碼框，編碼一個(gè)含167個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，5'非翻譯區(qū)長(zhǎng)41 bp，3'非翻譯區(qū)長(zhǎng)94 bp，該DHN2基因?qū)儆赮4SK2類型DHN，擴(kuò)增基因組的對(duì)應(yīng)區(qū)段發(fā)現(xiàn)在 DHN2基因中間區(qū)段含有95bp的內(nèi)含子序列，GenBank登錄號(hào)為HM228389。冷激處理后ChDH

9、N2基因表現(xiàn)逐漸地上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，24 h達(dá)到最大表達(dá)量，在種子中高豐度表達(dá)。利用基因組步移法獲取了兩個(gè)DHN基因的5’側(cè)翼序列，采用 PLANTCARE軟件分析順式作用元件，除了含有脅迫響應(yīng)元件 MYB核心序列、ABRE或MYCR等元件外，DHN1還含有一個(gè) CRT低溫響應(yīng)元件。構(gòu)建原核表達(dá)載體pET30a（+）-ChDHN2，在大腸桿菌BL21中表達(dá)出約30KDa的融合蛋白，過表達(dá)ChDHN2提高了大腸桿菌對(duì)低溫脅迫的抗性。構(gòu)建植物正