1、目的： 采用CCL4復(fù)合因素誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型，觀察正肝化瘀方對肝纖維化大鼠肝組織SOD、GSH、MDA和Hyp、a-SMA、I型、IV型膠原的影響，探討其對肝組織脂質(zhì)過氧化和膠原蛋白的作用；觀察正肝化瘀方對肝纖維化大鼠肝組織MMP-2/9、TIMP-1/2蛋白表達(dá)的影響，探討其對ECM合成和降解的作用；觀察正肝化瘀方對肝纖維化大鼠肝組織TNF-αmRNA、TNF-α、TNFR、P-IκB、NF-κB等蛋白表達(dá)的影響，探討其對

2、TNFR介導(dǎo)的TNF-a/NF-κB的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和肝星狀細(xì)胞凋亡的干預(yù)作用。從不同層面研究正肝化瘀方延緩、阻斷和逆轉(zhuǎn)肝纖維化的作用及機(jī)制，為中醫(yī)藥防治肝纖維化提供新思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1.肝纖維化大鼠模型的制備：SD大鼠48只，隨機(jī)分為正常組、模型組、正肝化瘀方組(治療組)、復(fù)方鱉甲軟肝片組(陽性對照組)，每組均為12只。采用CCLA復(fù)合因素造模方法，除正常組外，其余各組大鼠首劑均按5ml/kg體重劑量頸后皮下注

3、射40％CCl4橄欖油溶液，以后每周3次按3ml/kg體重頸后皮下注射40％CCl4橄欖油溶液，連用6周。除正常組外，各組前2周以高脂低蛋白飼料喂養(yǎng)，2周后以純玉米粉飼料喂養(yǎng)；正常組同時(shí)以等量生理鹽水頸后皮下注射，以普通飼料喂養(yǎng)。正肝化瘀方組按17g/kg大鼠體重的正肝化瘀方灌胃，復(fù)方鱉甲軟肝片組按25g/kg大鼠體重的劑量灌予復(fù)方鱉甲軟肝片，模型組、正常組同時(shí)以等量生理鹽水灌胃。在造模當(dāng)天開始，每日1次，連用6周。 2.樣品采

4、集與處理：第6周末，各組大鼠用2％戊巴比妥鈉以2ml/kg體重劑量腹腔注射麻醉，開腹觀察肝臟的大體情況。經(jīng)下腔靜脈采血，摘取肝、脾，稱重后，于肝臟左葉取肝組織2塊，投入液氮中用于抽提RNA測定；取1mm3肝組織用2％戊二醛和1％鋨酸溶液雙固定，送電鏡室觀察。另切取肝組織2塊，10％中性福爾馬林固定，24h后逐級酒精脫水，二甲苯透明，包埋、切片，用于HE、天狼星紅染色；其余肝組織切碎后放入1.5ml離心管中投進(jìn)液氮缸速凍，-70℃保存?zhèn)溆?/p>

5、。 3.主要觀測指標(biāo)和方法：實(shí)驗(yàn)中每天觀察大鼠一般情況并稱重，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后計(jì)算大鼠肝指數(shù)、脾指數(shù)，觀察大鼠肝臟外形、體積、顏色、質(zhì)地改變情況，肝組織切片HE染色光鏡觀察肝組織炎癥病理，天狼星紅染色觀察肝組織膠原沉積，透射電鏡觀察肝組織超微病理和膠原纖維，比色法檢測肝組織SOD、GSH活力和MDA含量，Jamall氏法檢測肝組織Hyp含量，Western blot法分析肝組織α-SMA與I型、Ⅳ型膠原的蛋白表達(dá)，明膠酶圖法檢測肝組織

6、MMP-2、MMP-9活性，Western blot法分析肝組織MMP-2、MMP-9與TIMP-1、TIMP-2的蛋白表達(dá)，RT-PCR法檢測肝組織TNF-α mRNA基因表達(dá)，Western blot法分析肝組織TNF-α、TNFR和P-IkB的蛋白表達(dá)，EMSA法檢測肝組織NF-kB蛋白的活性。 結(jié)果： 1.成功復(fù)制大鼠肝纖維化模型。模型組肝纖維化形成明顯，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝組織中膠原纖維含量和沉積明顯增加，電鏡觀

7、察顯示模型組大鼠肝細(xì)胞線粒體等細(xì)胞器的損傷明顯，Disse間隙的膠原蛋白顯著增多。正肝化瘀方組和復(fù)方鱉甲軟肝片組肝小葉結(jié)構(gòu)基本存在，Disse間隙的膠原蛋白比模型組顯著減少。脂質(zhì)過氧化檢測顯示，模型組SOD、GSH活力明顯下降，MDA含量明顯增加，正肝化瘀方組和復(fù)方鱉甲軟肝片組SOD、GSH活力較模型組有明顯提高，MDA含量有所下降低．模型組大鼠肝組織Hyp含量較正常組顯著升高，正肝化瘀方組和復(fù)方鱉甲軟肝片組大鼠肝組織Hyp含量較模型組

8、顯著降低，以正肝化瘀方組降低更為明顯。模型組大鼠肝組織α-SMA蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，正肝化瘀方組和復(fù)方鱉甲軟肝片組α-SMA蛋白表達(dá)明顯減弱。模型組肝組織I/IV型膠原蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)，正肝化瘀方組和復(fù)方鱉甲軟肝片組I/IV型膠原蛋白表達(dá)均有減弱，正肝化瘀方組I型膠原蛋白表達(dá)下調(diào)更為明顯． 2.明膠酶圖法顯示正常組大鼠肝組織MMP-2/9蛋白活性較低，而模型組大鼠肝組織MMP-2/9活性顯著升高，尤其是Action MMP-2升高

9、更明顯；正肝化瘀方組與復(fù)方鱉甲軟肝片組大鼠肝組織MMP-2/9活性較正常組均有升高，但與模型組比較，兩用藥組的MMP-2/9蛋白活性明顯下降；正肝化瘀方組MMP-9活性下降較復(fù)方鱉甲軟肝片組明顯。Western blot結(jié)果顯示，正常組大鼠肝組織MMP-2/9蛋白表達(dá)極低，TIMP-1/2蛋白少量表達(dá)；模型組大鼠肝組織MMP-2/9蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，TIMP-1/2蛋白表達(dá)也顯著增強(qiáng)；正肝化瘀方組與復(fù)方鱉甲軟肝片組大鼠肝組織MMP-2/

10、9蛋白和TIMP-1/2蛋白表達(dá)均較模型組減弱，以正肝化瘀方組下調(diào)MMP-9和TIMP-2蛋白表達(dá)更為明顯。 3.RT-PCR法結(jié)果顯示，正常組大鼠肝組織TNF-αmRNA基因有較低水平的表達(dá)，而模型組大鼠肝組織TNF-a mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)，正肝化瘀方組與復(fù)方鱉甲軟肝片組大鼠肝組織TNF-α mRNA表達(dá)較正常組均有升高，與模型組比較，正肝化瘀方組大鼠肝組織TNF-αmRNA的表達(dá)明顯減弱。Western blot結(jié)果顯示，

11、正常組大鼠肝組織有TNF-α、TNFR蛋白表達(dá)，P-IκB表達(dá)不明顯，模型組大鼠肝組織TNF-α、TNFR、P-IκB蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)；正肝化瘀方組與復(fù)方鱉甲軟肝片組大鼠肝組織TNF-α、TNFR蛋白表達(dá)均較模型組減弱，P-IκB蛋白表達(dá)有所減弱，以正肝化瘀方組下調(diào)TNFR、P-IκB蛋白表達(dá)更為明顯；EMSA法分析顯示，正常組大鼠肝組織NF-κB的活性很低，模型組大鼠肝組織NF-κB的活性顯著升高，正肝化瘀方組和復(fù)方鱉甲軟肝片組NF-

12、κB活性比正常組有明顯升高，但比模型組有所下降，正肝化瘀方組顯著降低肝組織NF-κB出活性。 結(jié)論： 1.正肝化瘀方能減輕肝細(xì)胞炎癥和線粒體損傷，抑制肝內(nèi)纖維增生和沉積；顯著提高CCL4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝組織SOD和GSH的活力，降低MDA含量；降低肝組織Hyp含量；下調(diào)α-SMA蛋白表達(dá)和減少肝組織中Ⅰ型、Ⅳ型膠原的沉積。正肝化瘀方有保護(hù)肝細(xì)胞、抗脂質(zhì)過氧化、減輕肝細(xì)胞損害及其脂肪變性、減少膠原生成和沉積的作用，其抗

13、肝纖維化機(jī)制與通過脂質(zhì)過氧化作用促進(jìn)自由基清除，抑制HSC活化和成纖維細(xì)胞的增殖，減少膠原合成與沉積有關(guān)． 2.正肝化瘀方能顯著降低大鼠肝組織MMP-2/9蛋白活性，下調(diào)肝組織。MMP-2/9蛋白和TIMP-1/2蛋白的表達(dá)，解除TIMPs對MMPs降解ECM酶活性的抑制作用，促進(jìn)ECM的降解，抑制肝纖維化的形成，促進(jìn)肝纖維化的逆轉(zhuǎn)。 3.正肝化瘀方可明顯抑制纖維化大鼠肝組織TNF-α RmRNA基因的表達(dá)，顯著下調(diào)大鼠