1、目的：觀察大鼠腦缺血預適應中自噬的激活，探討自噬激活在腦缺血預適應誘導的神經(jīng)保護中的作用，以及腦缺血預適應模型中自噬與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、熱休克蛋白HSP70之間的內(nèi)在聯(lián)系，探索自噬誘導劑能否模擬缺血預適應的生物效應用于防治缺血性腦中風引起的神經(jīng)損傷。 方法：本實驗中采用兩次插入線栓的方法制備局灶性腦缺血預適應模型；首次預缺血(IPC)時間為10 min，預缺血10 min后拔出線栓實現(xiàn)再灌，24 h后行再次插入線栓永久性阻塞大腦中動脈

2、(PFI)，自噬抑制劑3-methyladenin(3-MA)、自噬激活劑rapamycin(雷帕霉素)側(cè)腦室注射給藥，通過神經(jīng)癥狀評分、腦梗塞體積、腦含水量測定以及腦組織形態(tài)學檢測腦損傷程度。用電鏡觀察大鼠腦缺血預適應模型中自噬激活和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激情況，采用Western blot法檢測大鼠腦缺血預適應模型中自噬相關(guān)蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)蛋白及熱休克蛋白HSP70的表達。 結(jié)果：電鏡觀察顯示，IPC6h和24h皮層神經(jīng)元胞漿內(nèi)均有雙

3、層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體出現(xiàn)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激表現(xiàn)。PH組6h神經(jīng)元內(nèi)也有自噬小體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激表現(xiàn)，而在PFI組24h，神經(jīng)元出現(xiàn)為凋亡或壞死的形態(tài)特征。IPC+PFI組與PFI組相比較，神經(jīng)元核膜比較完整，細胞器結(jié)構(gòu)相對正常，在6 h和24 h胞漿內(nèi)均出現(xiàn)自噬小體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔擴張，腔內(nèi)出現(xiàn)灰白色聚集物。IPC+PFI可顯著改善大鼠的神經(jīng)行為學障礙，減小腦梗塞體積，減輕腦水腫(與PFI相比，P<0.01)，提示缺血預適應可誘導神經(jīng)保護作用。但3-MA

4、(200和400 nmol)，則顯著加重缺血大鼠的行為學障礙，使腦梗塞體積增大，腦水腫嚴重(與溶劑+IPC+PFI組相比，P<0.01)，提示自噬抑制劑取消了缺血預適應誘導的神經(jīng)保護作用。Western blot結(jié)果顯示，缺血后6 h， IPC，PFI，IPC+PFI以及溶劑+IPC+PFI組，LC3和Beclin1的表達均上調(diào)(與假手術(shù)組相比，P<0.01)，各組間無顯著差異，但缺血24 h，僅IPC，IPC+PFI組LC3、Becl

5、in1表達上調(diào)(與假手術(shù)組相比，P<0.01)，且IPC+PFI組較PFI LC3、Beclin1上調(diào)組更為顯著(P<0.01)；3-MA不論在6 h還是24 h都明顯抑制LC3、Beclin1的表達(與溶劑+IPC+PFI組相比，P<0.01)。缺血24 h，IPC，PFI組HSP70均顯著上調(diào)(與假手術(shù)組相比，P<0.01)，IPC+PFI以及溶劑+IPC+PFI組HSP70表達則更加增強(與PFI組相比，P<0.01)，但3-MA

6、則明顯抑制HSP70的表達(與溶劑+IPC+PFI組相比，P<0.01)。缺血后24 h，caspase-12在PFI組表達顯著升高(與假手術(shù)組相比，P<0.01)，但IPC+PFI組caspase-12表達下降(與PFI組相比，P<0.01)，3-MA則增加caspase-12的表達(與溶劑+IPC+PFI組相比，P<0.01)。提示3-MA阻斷缺血預適應的神經(jīng)保護作用與抑制自噬有關(guān)。自噬誘導劑雷帕霉素(8、16和32 ng)在PFI

7、24 h前給藥，與單純?nèi)毖M相比較，能顯著改善大鼠的神經(jīng)行為學障礙，減小腦梗塞的面積，減輕腦水腫(與PFI組相比，P<0.01)，提示預先激活自噬能產(chǎn)生對缺血的耐受。 結(jié)論：1.腦缺血預適應能誘導自噬激活和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。2.自噬抑制劑3-MA能阻斷腦缺血預適應誘導的神經(jīng)保護作用，可能是通過抑制LC3、Beclin1的表達，即通過抑制自噬-溶酶體途徑實現(xiàn)的。3.缺血預適應能誘導適宜的ER應激，上調(diào)HSP70，下調(diào)caspase-12