1、目的:缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)是指組織或器官在缺血的基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后,細(xì)胞功能代謝發(fā)生障礙及結(jié)構(gòu)損傷反而加重的現(xiàn)象。急性腎損傷(Acute kidney injury,AKI)是臨床的常見疾病,其患病率逐年攀升,AKI的定義為48h內(nèi)血肌酐(Serum creatinine,Scr)升高≥26.5umol/L;或者Scr增加≥基線值的1.5倍;或持續(xù)6h尿量<0.5ml/kg·h。

2、其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。腎IRI是導(dǎo)致缺血性AKI的主要原因之一。研究表明,免疫炎癥反應(yīng)是IRI的重要機(jī)制之一,其中炎性受體發(fā)揮著重要作用。Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是近年來發(fā)現(xiàn)的I型跨膜蛋白受體。它可以針對(duì)不同病原相關(guān)分子模式或損傷相關(guān)分子模式進(jìn)行識(shí)別、結(jié)合,引發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo),進(jìn)而導(dǎo)致炎性介質(zhì)的釋放,最終導(dǎo)致免疫炎癥反應(yīng)的發(fā)生。
　　有證據(jù)表明TLRs是參與激發(fā)缺血后免疫炎癥反應(yīng)的

3、主因,是組織損害的關(guān)鍵性傳感器。大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持TLRs作為炎癥和自身免疫性疾病的一個(gè)新靶點(diǎn)。阻斷或抑制TLRs信號(hào)通路節(jié)點(diǎn)藥物研究已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。但目前西藥對(duì)腎IRI的防治尚無有效的方法。千百年來中藥在辨證治療方面發(fā)揮了不可或缺的作用,中藥方劑的功效研究正吸引世界各地學(xué)者越來越多的關(guān)注。
　　本文通過建立大鼠腎IRI模型,探討中藥復(fù)方制劑復(fù)方腎華片(Fufang Shenhua Tablet,SHT)高、低兩種劑量對(duì)IR

4、I模型大鼠發(fā)生的AKI的腎臟保護(hù)作用,同時(shí)觀察IRI術(shù)后1周內(nèi)Toll樣受體2(Toll-like receptor 2,TLR2)和Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)及相關(guān)的炎癥細(xì)胞因子的蛋白及mRNA表達(dá),以及TLRs信號(hào)傳導(dǎo)通路中髓樣細(xì)胞分化因子(myeloid differentiation factor 88,MyD88)的蛋白及mRNA表達(dá)。從TLRs信號(hào)傳導(dǎo)通路改變上來揭示SHT對(duì)IRI

5、大鼠的腎臟保護(hù)作用及其可能的機(jī)制。
　　方法:(1)首先通過采用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉大鼠的雙側(cè)腎蒂方式來建立Wistar大鼠腎IRI模型,根據(jù)腎臟缺血的時(shí)間不同,大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組(Sham組)、20min組、30min組、40min組及50min組,缺血再灌注1d后用全自動(dòng)生化測(cè)定儀檢測(cè)大鼠血肌酐(Serumcreatinine,Scr)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN);大鼠腎臟組織制作石蠟切片,PAS染色

6、后光學(xué)顯微鏡下觀察腎小管的損傷程度。用顯微圖像采集分析系統(tǒng)對(duì)大鼠腎臟病理組織形態(tài)學(xué)的變化和腎小管損傷程度進(jìn)行評(píng)分,比較不同的缺血時(shí)間對(duì)腎臟的上述指標(biāo)的影響;同時(shí)進(jìn)行大鼠腎缺血50min組的術(shù)后1周生存率觀察。在確定理想的大鼠腎缺血時(shí)間后,將Wistar大鼠隨機(jī)分成兩組,一組將右側(cè)腎切除,左側(cè)腎蒂夾閉;另一組行雙側(cè)腎蒂夾閉。觀察術(shù)后1d、3d、5d、7d血肌酐、尿素氮變化以及術(shù)后1周大鼠生存率,繪制生存率曲線。篩選出理想的大鼠IRI模型所

7、需的術(shù)式和腎蒂缺血夾閉時(shí)間。
　　(2)將大鼠隨機(jī)分為4組:假手術(shù)組(Sham)、模型對(duì)照組(Model)、復(fù)方腎華片低劑量組(SHT-L)和復(fù)方腎華片高劑量組(SHT-H)。給予治療藥物每天灌胃1次,7天后采用雙側(cè)腎蒂夾閉40min方法建立腎IRI模型,觀察大鼠術(shù)后24h和72h生命體征;用全自動(dòng)生化測(cè)定儀檢測(cè)血BUN、Scr;光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠腎組織的腎小管損傷程度,并用計(jì)算機(jī)顯微圖像采集分析系統(tǒng)對(duì)腎小管損傷程度進(jìn)行評(píng)分。觀

8、察和評(píng)估復(fù)方腎華片(SHT)的腎臟保護(hù)作用。
　　(3)將大鼠隨機(jī)分為5組:假手術(shù)組(Sham)、模型對(duì)照組(Model)、黃芪甲苷組(Astragaloside)、復(fù)方腎華片低劑量組(SHT-L)和復(fù)方腎華片高劑量組(SHT-H)。給予相應(yīng)藥物每天灌胃1次,7天后采用右腎切除,左側(cè)腎蒂夾閉40min方法建立腎IRI模型,觀察術(shù)后24h和72h大鼠的生命體征;用全自動(dòng)生化測(cè)定儀檢測(cè)血BUN、Scr;光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠腎組織的腎小

9、管損傷程度,并用顯微圖像采集分析系統(tǒng)對(duì)腎小管損傷程度進(jìn)行評(píng)分;JEM-1400型電子顯微鏡觀察腎小管上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化,并作量化分析。
　　(4)將大鼠隨機(jī)分為5組:假手術(shù)組(Sham)、模型對(duì)照組(Model)、黃芪甲苷組(Astragaloside)、復(fù)方腎華片低劑量組(SHT-L)和復(fù)方腎華片高劑量組(SHT-H),分別給予相應(yīng)藥物灌胃7天后,采用右側(cè)腎切除,左側(cè)腎蒂夾閉40min法建立缺血再灌注模型,通過石蠟切片免疫組織

10、化學(xué)ABC法(Immunohistochemistry,IHC-P)、蛋白印跡法(Western blot,WB)和ABI7900HT實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)(Real-time quantitative PCR detecting system,qPCR)檢測(cè)大鼠術(shù)后1d、3d、5d、7d腎組織Toll樣受體2(Toll-likereceptors2,TLR2)、Toll樣受體4(Toll-like receptors 4,TLR

11、4)、髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)、白細(xì)胞介素-6(interleukin 6,IL-6)和白細(xì)胞介素-12(interleukin 12,IL-12)蛋白分子及其mRNA水平表達(dá),白細(xì)胞介素-8(interleukin 8,IL-8)和干擾素-γ(IFN-gamma,IFN-γ)的蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:(1)實(shí)驗(yàn)中手術(shù)造模成功率達(dá)97.6％,與Sham組相

12、比,雙側(cè)腎蒂夾閉30min組,再灌注1d后血尿素氮、肌酐及腎臟病理損害評(píng)分均升高(P<0.05),而20min組上述指標(biāo)均無顯著性差異(P>0.05)。與Sham組相比,雙側(cè)腎蒂夾閉40min組和50min組,再灌注1d后血尿素氮、肌酐和腎臟病理損害評(píng)分均顯著異常(P<0.01)。右側(cè)腎切除,左側(cè)腎蒂夾閉組與雙側(cè)腎蒂夾閉組比較,術(shù)后1周兩組間血肌酐和生存率無顯著差異(P>0.05)。腎缺血50min組的生存率下降顯著,僅為50%。

13、>　　(2)與Sham組相比,術(shù)后24h和72h,Model組大鼠的腎功及腎臟病理均顯著異常(P<0.01)。與Model組相比,術(shù)后24h和72h,SHT-L組大鼠的腎功及腎組織病理損害均減輕(P<0.05),SHT-H組腎功及腎組織病理損害減輕更明顯(P<0.01);SHT-H組大鼠的腎功及腎組織病理損害均輕于SHT-L組(P<0.05)。
　　(3)IRI術(shù)后24h,腎功、腎臟光鏡和電鏡病理損害達(dá)峰值,術(shù)后72h上述指標(biāo)均得

14、到部分恢復(fù)。術(shù)后24h和72h,Astragaloside組和SHT-L組腎功、腎臟光鏡和電鏡病理損害均較Model組顯著改善(P<0.05),SHT-H組改善更顯著(P<0.01);Astragaloside組和SHT-L組上述指標(biāo)結(jié)果相似(P>0.05),SHT-H組上述指標(biāo)改善程度優(yōu)于Astragaloside組和SHT-L組(P<0.05)。
　　(4)與Model組相比,大鼠IRI術(shù)后1d、3d、5d、7d,Astrag

15、aloside組和SHT-L組TLR2和TLR4蛋白分子及mRNA表達(dá)均降低(P<0.05),SHT-H組TLR2和TLR4蛋白分子及mRNA表達(dá)下降最顯著(P<0.01)。各組大鼠IRI術(shù)后5dTLR2和TLR4蛋白分子及mRNA表達(dá)均達(dá)峰值;與Astragaloside組和SHT-L組比較,IRI術(shù)后1d、3d、5d、7d,SHT-H組TLR2和TLR4蛋白分子及mRNA表達(dá)均明顯下降(P<0.05);Astragaloside組和

16、SHT-L組TLR2和TLR4蛋白分子及mRNA表達(dá)無差異(P>0.05)。與Model組相比,大鼠IRI術(shù)后1d、3d、5d、7d,Astragaloside組、SHT-L組和SHT-H組IL-6、IL-12和MyD88蛋白分子及mRNA表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。術(shù)后1dIL-8和TNF-γ蛋白表達(dá)水平最高,術(shù)后3dIL-6、IL-12蛋白分子及mRNA表達(dá)水平達(dá)峰值,術(shù)后5d各組MyD88蛋白分子及mRNA表達(dá)水平達(dá)峰值。術(shù)后

17、1d、3d、5d、7d,與Astragaloside組和SHT-L組比較,SHT-H組MyD88蛋白分子及mRNA表達(dá),以及IL-8和IFN-γ蛋白表達(dá)均明顯下降(P<0.05);Astragaloside組和SHT-L組比較,無論MyD88蛋白分子和mRNA表達(dá),還是IL-8和TNF-γ蛋白表達(dá),兩組均無顯著差異(P>0.05)。
　　結(jié)論:(1)采用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉大鼠腎蒂的方法可以制備穩(wěn)定的腎IRI模型,大鼠造模較為理想的腎缺

18、血時(shí)間是40min,右側(cè)腎切除,左側(cè)腎蒂夾閉法與雙側(cè)腎蒂夾閉法造模均可行,術(shù)后生存率較高,所得模型效果滿意。(2)無論是中藥復(fù)方(SHT)還是單味中藥(Astragaloside)均可明顯改善腎IRI大鼠的生存質(zhì)量,保護(hù)腎臟功能,減輕腎臟病理損害,其中低劑量SHT與Astragaloside療效相似,但高劑量SHT療效優(yōu)于Astragaloside,提示中藥復(fù)方優(yōu)于單味中藥。(3)SHT可抑制腎IRI大鼠免疫炎癥受體TLR2和TLR4的