1、胰腺癌惡性程度高，預(yù)后差，早期診斷困難，只有很少部分患者可以進(jìn)行手術(shù)治療，大部分患者發(fā)現(xiàn)病情時已經(jīng)失去手術(shù)機(jī)會，傳統(tǒng)的放療和化療手段療效不佳。所以，我們開始探索新的途徑來醫(yī)治胰腺癌。表皮生長因子受體(EGFR)在多種實質(zhì)性上皮源性腫瘤中，如胰腺癌、乳腺癌和大腸癌等均有過度表達(dá)和異?；罨c腫瘤的有絲分裂、凋亡抑制、細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移、血管形成，以及對常規(guī)細(xì)胞毒性治療的抵抗均密切相關(guān)。因此EGFR已成為腫瘤靶向治療中一個重要的靶點(diǎn)和熱點(diǎn)。本實

2、驗擬將抗EGFR基因治療與新型載體重組腺相關(guān)病毒相結(jié)合，利用噬菌體抗體庫獲得人抗EGFR單鏈抗體可變區(qū)(SCFV)基因，構(gòu)建能在體內(nèi)長期表達(dá)抗EGFR抗體的重組腺相關(guān)病毒(rAAV)載體，以胰腺癌細(xì)胞株和裸鼠胰腺癌種植瘤為模型，探討其治療腫瘤的可行性和有關(guān)機(jī)理，為臨床開展抗EGFR基因治療提供科學(xué)依據(jù)。 研究方法： 1、將人抗EGFR單鏈抗體可變區(qū)(SCFV)基因插入腺相關(guān)病毒載體的酶切位點(diǎn)，構(gòu)建能在體內(nèi)長期表達(dá)抗EGF

3、R抗體的重組腺相關(guān)病毒載體；2、通過Westernblot方法驗證抗EGFR抗體在293細(xì)胞、人胰腺癌細(xì)胞株和裸鼠胰腺癌種植瘤模型腫瘤組織中的表達(dá)；3、體外實驗：人胰腺癌細(xì)胞株實驗，包括(1)用WST-8法觀察抗EGFR抗體對人胰腺癌細(xì)胞株增殖的影響；(2)利用Annexin V-FITC/PI雙染技術(shù)，流式細(xì)胞儀檢測人胰腺癌細(xì)胞的凋亡情況； 4、體內(nèi)實驗：裸鼠胰腺癌種植瘤模型實驗，包括(1)腫瘤體積測定；(2)提取腫瘤組織總RNA，應(yīng)

4、用RT_：PCR技術(shù)觀察腫瘤VEGF轉(zhuǎn)錄水平的變化；(3)應(yīng)用免疫組化技術(shù)，CD31染色腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，顯微鏡下測定平均微血管密度(MVD)。 結(jié)果： 1、成功了構(gòu)建攜帶抗EGFR抗體的重組腺相關(guān)病毒載體，并通過酶切和PCR方法進(jìn)行鑒定； 2、抗EGFR抗體在293細(xì)胞、6株人胰腺癌細(xì)胞株(Panc-1、SW1990、Aspc-1、Capan-1.1、PCT-3及MiaPaCa-2)和裸鼠種植瘤模型腫瘤組織中有

5、明顯表達(dá)； 3、在增殖實驗中，抗EGFR抗體能抑制ASPC-1胰腺癌細(xì)胞的增殖(抑制率15.1±3.5％，與載體對照組相比有顯著差異，P<0.05)； 4、在凋亡實驗中，抗EGFR抗體能引起6株人胰腺癌細(xì)胞株的明顯凋亡(Panc-1：9.1％vs.0.4％；SWl990:17.2％vs.0.8％；Aspc-150.9％vs.0.8％；Capan-1:19.2％vs.0.8％；PCT-3:10.2％vs.0.5％；MiaP

6、aCa-2:28.6％vs.3.0％)； 5、在裸鼠胰腺癌種植瘤模型實驗中，抗EGFR抗體在固定的觀察時間內(nèi)，能使腫瘤體積的增加量明顯減少(1.38±0.83cm3 vs.4.60±2.17cm3，p<0.05)；抗EGFR抗體與健擇聯(lián)合治療組也能使腫瘤體積的增加量明顯減少(0.13±0.19cm3vs.4.60±2.17cm3，p<0.05)；與健擇聯(lián)合使用能明顯增強(qiáng)抗EGFR抗體的作用(0.13±0.19cm3 vs.1.3

7、8±0.83cm3，p<0.05)。 6、在裸鼠胰腺癌種植瘤模型實驗中，抗EGFR抗體組與對照組相比，VEGF mRNA轉(zhuǎn)錄水平有下降趨勢，但是沒有達(dá)到顯著差異(0.10±0.06 vs.0.35±0.24，p>0.05)；抗EGFR抗體與健擇聯(lián)合治療組與對照組相比，能顯著降低VEGFmRNA轉(zhuǎn)錄水平(0.08±0.05 vs.0.35±0.24，P<0.05)；抗EGFR抗體治療組和抗EGFR抗體與健擇聯(lián)合治療組相比沒有顯著差

8、異(0.10±0.06 vs.0.08±0.05，p>0.05)； 7、在裸鼠胰腺癌種植瘤模型實驗中，抗EGFR抗體組與對照組相比，平均微血管密度顯著降低(41.4±5.4 vs.58.2±6.1，p<0.05)；抗EGFR抗體與健擇聯(lián)合治療組與對照組相比，能顯著降低VEGF mRNA轉(zhuǎn)錄水平(26.8±4.5 vs.58.2±6.1，P<0.05)；與健擇聯(lián)合使用能明顯增強(qiáng)抗EGFR抗體的作用(26.8±4.5 vs。41.4