1、目的：本課題通過對比銅綠假單胞菌野生株P(guān)AOl及密度感知系統(tǒng)(QS)las和rhl基因缺失的雙變異株P(guān)AO-JP2的生物學(xué)特性，探討QS系統(tǒng)對銅綠假單胞菌致病性、耐藥性的影響；并通過對經(jīng)羅紅霉素、阿奇霉素、乙酰螺旋霉素處理后的PAOl、PAO-JP2生物被膜的形態(tài)、致病因子以及l(fā)asR基因轉(zhuǎn)錄水平比較，探討阿奇霉素等大環(huán)內(nèi)酯類藥物對QS系統(tǒng)在銅綠假單胞菌生物被膜致病性、生物被膜的形成以及在轉(zhuǎn)錄水平干擾密度感知信號因子AHL的合成的影響。

2、 方法：采用改良的組織培養(yǎng)平板法建立PAOl及PAO-JP2生物被膜模型；應(yīng)用銀染法快速鑒定進(jìn)行PAOl及PAO-JP2生物被膜形態(tài)學(xué)的比較，采用計算機(jī)圖像處理系統(tǒng)對銀染法快速鑒定后的硅膠片進(jìn)行圖像分析；應(yīng)用瓊脂平板稀釋法測定3種大環(huán)內(nèi)酯類藥物對PAOl、PAO-JP2的MIC值：應(yīng)用PTSB培養(yǎng)基培養(yǎng)及酶．底物反應(yīng)后測量吸光度值觀察大環(huán)內(nèi)酯類藥物對銅綠假單胞菌胞外毒力因子彈性蛋白酶(elastase，El)的影響；應(yīng)用TSBD

3、培養(yǎng)基培養(yǎng)應(yīng)用SDS-PAGE以及Westem-Blot技術(shù)觀察大環(huán)內(nèi)酯類藥物對銅綠假單胞菌胞外毒力因子外毒素(toxA)的影響；應(yīng)用M-H瓊脂平板培養(yǎng)、TRizol法提取RNA利用反轉(zhuǎn)錄技術(shù)(RT-PCR)觀察大環(huán)內(nèi)酯類藥物對lasR基因轉(zhuǎn)錄水平上的影響。 結(jié)果：應(yīng)用銀染法快速鑒定及計算機(jī)圖像處理系統(tǒng)分析觀察不同濃度羅紅霉素、阿奇霉素、乙酰螺旋霉素處理的PAOl、PAO0-P2生物被膜，可見隨著羅紅霉素、阿奇霉素濃度增大(20

4、ug/ml，40ug/ml，80ug/ml)，PAOl、PAO-JP2生物被膜菌逐漸被清除，細(xì)菌量逐漸減少，同一濃度下，對PAOl較PAO-JP2清除明顯，乙酰螺旋霉素處理組此現(xiàn)象不明顯；PTSB培養(yǎng)基培養(yǎng)及酶-底物反應(yīng)后測量吸光度值觀察大環(huán)內(nèi)酯類藥物對銅綠假單胞菌彈性蛋白酶的影響可見隨著阿奇霉素、羅紅霉素的濃度增加，吸光度值呈下降趨勢，乙酰螺旋霉素處理組此現(xiàn)象不明顯；TSBD培養(yǎng)基培養(yǎng)應(yīng)用SDS-PAGE以及Westem-Blot技術(shù)

5、觀察大環(huán)內(nèi)酯類藥物對銅綠假單胞菌外毒素的影響，可見隨著羅紅霉素、阿奇霉素的濃度增加，外毒素條帶灰度減弱示其生成呈下降趨勢，乙酰螺旋霉素處理組此現(xiàn)象不明顯；利用反轉(zhuǎn)錄技術(shù)(RT-PCR)觀察大環(huán)內(nèi)酯類藥物對lasR基因轉(zhuǎn)錄水平上的影響可見lasR基因轉(zhuǎn)錄隨著阿奇霉素的濃度增加，lasR條帶灰度減弱示其生成呈下降趨勢，PAO-JP2組未發(fā)現(xiàn)lasR條帶。 結(jié)論：銅綠假單胞菌是產(chǎn)生細(xì)菌生物被膜主要致病菌。本研究發(fā)現(xiàn)大環(huán)內(nèi)酯類藥物在生物

6、被膜培養(yǎng)過程中分別處理PAOl、PAO-JP2，結(jié)果提示大環(huán)內(nèi)酯類藥物(14、15元環(huán))通過對QS系統(tǒng)的影響可有效抑制銅綠假單胞菌生物被膜的形成；通過QS系統(tǒng)有效抑制銅綠假單胞菌的毒力因子的產(chǎn)生，16元環(huán)的大環(huán)內(nèi)酯類藥物乙酰螺旋霉未見上述結(jié)論；lasR基因的反轉(zhuǎn)錄絡(luò)果提示阿奇霉素可在轉(zhuǎn)錄水平抑制QS系統(tǒng)發(fā)揮其作用。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)大環(huán)內(nèi)酯類藥物阿奇霉素通過抑制銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)的lasR基因轉(zhuǎn)錄，有效的抑制相關(guān)致病因子彈性蛋白酶和