1、研究背景和目的：骨肉瘤為最常見的原發(fā)于骨組織的惡性腫瘤，好發(fā)于青少年，預后較差。Survivin是近年來發(fā)現的凋亡抑制蛋白家族的一個新成員。那么Survivin在骨肉瘤組織和細胞中是否呈高表達，且其表達程度是否與骨肉瘤的惡性程度及侵襲能力相關?在本文中通過免疫組化研究了Survivin，Cox-2在骨肉瘤組織中的表達情況，初步探討其在骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用，明確其在骨肉瘤病理診斷中的意義。 第一部分：凋亡抑制蛋白Survivi

2、n在骨肉瘤組織中的表達及其與Cox-2表達相關性的實驗研究 論文1骨肉瘤組織中Survivin，Cox-2的表達及其意義 目的：研究Survivin，Cox-2在骨肉瘤中的表達情況，初步探討其在骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用，明確其在骨肉瘤病理診斷中的意義。方法：應用免疫組化SP法，檢測38例骨肉瘤組織的臨床標本及20例骨軟骨瘤組織中Survivin，Cox-2蛋白的表達。結果：發(fā)現在65.8％的骨肉瘤組織中Survivin的

3、表達陽性，骨軟骨瘤組織的表達率為20.0％(P＜0.01)。57.9％的骨肉瘤組織表達Cox-2陽性，顯著高于骨軟骨瘤組織的表達率(25.0％)(P＜0.05)。在組織切片中Survivin、Cox-2陽性細胞均表現為胞漿或胞膜染為棕黃色。Survivin、Cox-2在骨肉瘤中表達顯著高于其在骨軟骨瘤中的表達，且其表達率的高低與骨肉瘤的分化程度和臨床分期密切相關。Survivin表達上調和Cox-2表達上調與骨肉瘤的臨床分期密切相關，S

4、urvivin的表達與Cox-2的表達密切相關。結論：在骨肉瘤組織中Survivin、Cox-2的表達異常，提示它們可能對骨肉瘤的發(fā)展起重要作用。 論文2NS-398對骨肉瘤細胞的作用及其對Survivin表達的影響 目的：觀察選擇性的環(huán)氧合酶-2抑制劑NS-398對人骨肉瘤細胞系MG-63的凋亡的影響及其對Survivin基因表達的影響。方法：體外培養(yǎng)骨肉瘤細胞系MG-63，應用MTT法研究不同濃度NS-398對骨肉瘤

5、細胞系MG-63的凋亡誘導作用，流式細胞儀檢測細胞凋亡率的變化，RT-PCR法分析NS-398對骨肉瘤細胞系MG-63中Survivin基因表達的影響。結果：NS-398可誘導骨肉瘤細胞系MG-63發(fā)生凋亡，并具有劑量依賴性，在NS-398濃度為200μmol/L時，對細胞生長有明顯的抑制作用。流式細胞儀檢測顯示NS-398引起MG-63細胞凋亡率增加。RT-PCR分析顯示經NS-398作用后的骨肉瘤細胞系MG-63表達Survivin

6、較用藥前明顯下降。結論：NS-398對骨肉瘤細胞系MG-63有殺傷作用，其作用可能通過抑制Survivin的表達，促進腫瘤細胞的凋亡的發(fā)生。 第二部分Survivin反義寡核苷酸對骨肉瘤細胞的作用及其機制 論文1Survivin反義寡核苷酸對骨肉瘤細胞增殖的抑制作用 目的：采用合成的Survivin反義寡核苷酸(ASODN)作用于骨肉瘤細胞系MG-63，觀察其對骨肉瘤細胞系MG-63增殖和凋亡的影響。方法：以脂質

7、體為載體，介導不同濃度Survivin反義寡核苷酸轉染于人骨肉瘤細胞系MG-63，應用MTT法和形態(tài)學檢測研究不同濃度Survivin反義寡核苷酸對骨肉瘤細胞系MG-63的生長抑制作用，流式細胞儀檢測轉染Survivin反義寡核苷酸后的細胞凋亡率，Hochest33258熒光染色法觀察細胞形態(tài)學改變，DNAladder檢測細胞凋亡。結果：脂質體介導Survivin反義寡核苷酸轉染骨肉瘤細胞系MG-63后，可誘導骨肉瘤細胞MG-63發(fā)生凋

8、亡，不同濃度的ASODN引起的凋亡率不同，細胞增殖明顯受到抑制，其中以600nmol/L的ASODN轉染組抑制作用最顯著。DNAladder檢測發(fā)現典型的DNA梯形。形態(tài)學檢測發(fā)現ASODN轉染后細胞發(fā)生凋亡、增殖發(fā)生抑制。結論：脂質體介導轉染Survivin反義寡核苷酸可以有效抑制細胞增殖，促進細胞凋亡。 論文2Survivin反義寡核苷酸轉染對骨肉瘤細胞Survivin、fas基因表達的影響 目的：采用合成的Surv

9、ivin反義寡核苷酸(ASODN)封閉骨肉瘤細胞Survivin的作用，觀察其對骨肉瘤細胞系MG-63Survivin及Fas基因表達的影響。方法：以脂質體為載體，介導Survivin反義寡核苷酸轉染于人骨肉瘤細胞系MG-63，半定量RT-PCR檢測轉染Survivin反義寡核苷酸后的骨肉瘤細胞SurvivinmRNA表達和FasmRNA表達的變化，Western-blot方法檢測轉染Survivin反義寡核苷酸后的骨肉瘤細胞Survi

10、vin蛋白和Fas蛋白的變化。結果：脂質體介導Survivin反義寡核苷酸轉染骨肉瘤細胞系MG-63后，骨肉瘤細胞Survivin蛋白及mRNA表達均明顯降低，而Fas蛋白和mRNA表達均明顯增高。結論：脂質體介導轉染Survivin反義寡核苷酸可以有效降低細胞內Survivin基因的蛋白和mRNA的表達并提高Fas基因蛋白和mRNA的表達，從而促進細胞凋亡。 第三部分Survivin反義核酸載體的構建及其對骨肉瘤細胞增殖、侵襲

11、能力的影響 論文1反義pEGFP-C1-Survivin真核表達載體的構建與鑒定 目的：構建人Survivin基因的反義真核表達載體并鑒定，特異性的封閉人骨肉瘤細胞MG-63中Survivin基因的表達，觀察SurvivinmRNA的表達變化。方法：采用RT-PCR的方法，從人骨肉瘤細胞中擴增出459bp的Survivin基因的cDNA片段，經T載體克隆后以BamHI和EcoRI兩個酶切位點雙酶切，定向克隆到真核表達載體

12、pEGFP-C1中，構建成反義pEGFP-C1-Survivin真核表達載體。對重組質粒進行限制性酶切分析及測序鑒定。通過脂質體法轉染人骨肉瘤細胞株MG-63，應用RT-PCR法檢測轉染前后SurvivinmRNA的表達變化。結果：成功構建出了反義pEGFP-C1-Survivin真核表達載體并經鑒定正確，轉染反義pEGFP-C1-Survivin真核表達質粒后骨肉瘤細胞的SurvivinmRNA的表達較轉染前明顯降低。結論：反義pEG

13、FP-C1-Survivin真核表達載體在人骨肉瘤細胞株MG-63中發(fā)揮了特異性的封閉作用。為進一步研究Survivin的分子生物學特性及致瘤機理及今后利用反義Survivin核酸載體治療骨肉瘤提供了實驗和理論模型。 論文2反義pEGFP-C1-Survivin真核表達載體對骨肉瘤細胞生物學行為的影響 目的：觀察Survivin反義核酸載體對人骨肉瘤細胞系MG-63生物學行為的抑制效應，并初步探討其相關機制。方法：反義p

14、EGFP-C1-Survivin真核表達載體轉染入MG-63細胞中。MTT實驗檢測轉染前后增殖能力的變化，Boyden小室體外侵襲實驗測定轉染前后侵襲能力的變化。RT-PCR和Westernblot分析轉染前后Ang-2基因mRNA和蛋白表達的變化。結果：反義pEGFP-C1-Survivin真核表達載體成功轉染入骨肉瘤細胞株MG-63中，并經穩(wěn)定篩選得到穩(wěn)定轉染的細胞。MTT檢測顯示轉染后骨肉瘤細胞的增殖明顯受抑制，轉染組與其他各組之

15、間有顯著性差異(P＜0.01)，脂質體組、空質粒組和空白組之間差異無顯著性(P＞0.05)。RT-PCR和Westernblot分析結果顯示轉染反義pEGFP-C1-Survivin真核表達載體后，MG-63Ang-2基因mRNA和蛋白的表達較轉染前明顯下降，與空白組、脂質體組和空質粒組之間有顯著差異(P＜0.01)，而另三組之間差異不顯著(P＞0.05)。Boyden小室體外侵襲實驗測定侵襲能力顯示轉染組侵襲能力明顯下降。與其他各組間