1、目的：細(xì)胞是組織構(gòu)建的基礎(chǔ)，目前種子細(xì)胞的體外擴(kuò)增需要3周左右時(shí)間，體外構(gòu)建組織工程骨要想滿足臨床需要，如何使種子細(xì)胞大量，快速，優(yōu)質(zhì)擴(kuò)增是面臨的首要問題。本實(shí)驗(yàn)室前期工作證明，特定參數(shù)的脈沖電磁場(chǎng)(pulsedelectromagneticfields，PEMFs)能夠?qū)θ斯撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞(humanmesenchymalstemcells，hMSCs)的增殖產(chǎn)生促進(jìn)作用，并誘導(dǎo)成骨。然而刺激的頻率不同，是否會(huì)對(duì)細(xì)胞增殖及分化產(chǎn)生不同

2、的影響?在組織工程骨的體外構(gòu)建中我們應(yīng)該選擇怎樣的合適頻率范圍?細(xì)胞是以群體而不是以孤立的形式生長(zhǎng)，細(xì)胞間存在物質(zhì)和信息交換，脈沖電磁場(chǎng)是否會(huì)對(duì)縫隙連接細(xì)胞間通訊(Gapjunctionalintercellularcom-munication，GJIC)功能產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖分化?這些問題尚缺乏系統(tǒng)的研究。本研究旨在探討不同頻率段PEMFs刺激對(duì)hMSCs體外增殖分化的作用，以期找出適合的頻率范圍，為應(yīng)用PEMFs促進(jìn)hMSC

3、s快速大量?jī)?yōu)質(zhì)擴(kuò)增，誘導(dǎo)成骨分化，研制新型生物反應(yīng)器，以及進(jìn)一步研究PEMFs刺激對(duì)MSCs生物學(xué)效應(yīng)的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：1、頻率分組：選擇1-150Hz頻率范圍，將體外培養(yǎng)的第三代hMSCs分為5、25、50、75、100、150HzPEMF刺激組和不施加PEMF的對(duì)照組。2、參數(shù)選擇：脈沖電磁場(chǎng)刺激強(qiáng)度1.1mT，時(shí)間30min/d，持續(xù)作用21天。3、倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。4、四氮噻唑鹽(MTT)比色法檢測(cè)h

4、MSCs的增殖，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。5、流式細(xì)胞儀檢測(cè)hMSCs細(xì)胞周期。6、酶化學(xué)法測(cè)定細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性。7、放免法測(cè)定細(xì)胞骨鈣素的分泌情況。9、茜素紅鈣染色檢測(cè)鈣結(jié)節(jié)的形成。9、透射電鏡觀察hMSCs超微結(jié)構(gòu)，觀察細(xì)胞間縫隙連接。10、采用熒光光漂白恢復(fù)(Fluorescenceredistributionafterphotobleaching，F(xiàn)RAP)技術(shù)，通過激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)hMSCs經(jīng)PEMF刺激后的縫隙連接功

5、能(GJIC)變化。 結(jié)果：1、經(jīng)PEMF刺激的hMSCs，3d后密度較對(duì)照組增高，體積逐漸增大，形態(tài)變?yōu)槿切巍⒍嘟切?、鱗形，胞漿中含有較多的基質(zhì)成分和顆粒狀物質(zhì)。不同頻率的PEMF作用組間細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯差別。隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞逐漸匯合呈鋪路石狀，進(jìn)而出現(xiàn)重疊生長(zhǎng)，基質(zhì)堆積，3周后基質(zhì)礦鹽沉積并融合成圓形或卵圓形的鈣化結(jié)節(jié)。2、MTT檢測(cè)顯示經(jīng)PEMFs刺激后的hMSCs增殖能力明顯比對(duì)照組強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組生長(zhǎng)曲線前移，并

6、且峰值增高。其中50Hz刺激組生長(zhǎng)曲線最高，明顯快于其他頻率刺激組(P＜0.05)。3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)表明，經(jīng)PEMFs作用以后，所有樣本均未發(fā)現(xiàn)有DNA倍體異常的細(xì)胞(diploid：100％)；hMSCs細(xì)胞周期發(fā)生了改變，S期細(xì)胞百分比增高。刺激頻率不同，細(xì)胞周期改變不一，其中以50Hz頻段效果最為明顯，S期細(xì)胞百分比(28.09±0.25)％較對(duì)照組(13.57±0.15)％增高107％，也明顯高于其他頻率刺激組(P＜0.05)

7、。4、ALP活性檢測(cè)的前6d，除5Hz組外各頻率組hMSCs的ALP水平比對(duì)照組有增高，但組間無(wú)明顯差異；隨著刺激時(shí)間延長(zhǎng)，各PEMF刺激組ALP活性增強(qiáng)更為明顯，12d基本達(dá)到高峰；15d時(shí)變化不大，基本到達(dá)穩(wěn)定值，各刺激組均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照組水平(P＜0.05)。其中50Hz刺激組明顯高于其它頻率刺激組(P＜0.05)。5、骨鈣素定量檢測(cè)，第1周，對(duì)照組骨鈣素測(cè)不出，各刺激組間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；.第2周，對(duì)照組骨鈣素測(cè)不出，

8、各刺激組間有顯著性差異(P＜0.05)；第3周，各刺激組間和對(duì)照組間以及各刺激組間有顯著性差異，其中50Hz組骨鈣素含量最高(P＜0.05)。6、透射電鏡下觀察到經(jīng)PEMF刺激的hMSCs核質(zhì)比例較小，胞質(zhì)內(nèi)有豐富的細(xì)胞器，如線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等；相鄰細(xì)胞間可以看見一些細(xì)胞膜局部電子密度增高的縫隙連接結(jié)構(gòu)。7、熒光光漂白恢復(fù)法(FRAP)測(cè)定PEMF刺激組和對(duì)照組細(xì)胞GJIC功能，F(xiàn)EMF刺激組細(xì)胞平均熒光恢復(fù)率為(64.12

9、±0.83)％，對(duì)照組細(xì)胞平均熒光恢復(fù)率為(35.26±0.76)％，二者比較有顯著性差異(P＜0.05)，表明經(jīng)PEMF刺激的hMSCs縫隙連接通訊功能明顯提高。 結(jié)論：頻率是影響脈沖電磁場(chǎng)促人間充質(zhì)干細(xì)胞增殖分化的重要因素之一。脈沖電磁場(chǎng)刺激頻率不同，對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的促增殖分化作用不一，50Hz可能是促進(jìn)hMSCs體外增殖分化的適合頻率。PEMFs對(duì)hMSCs的細(xì)胞間縫隙連接通訊(GJIC)功能有顯著促進(jìn)作用，而GJIC功能