1、真菌病毒普遍存在于各類真菌中，因其很少使寄主出現(xiàn)異常表型而難以引起人們的關(guān)注。植物病原真菌內(nèi)存在一些可導(dǎo)致病原寄主出現(xiàn)病毒性致病力衰退的真菌病毒，并被成功應(yīng)用于植物病害的生物防治，但病原寄主種內(nèi)復(fù)雜的營養(yǎng)體不親和性限制了病毒的傳播擴(kuò)散，隨之影響到致病力衰退相關(guān)病毒的控病效果和應(yīng)用范圍。核盤菌是一種重要的植物病原真菌，由核盤菌引起的菌核病是世界性分布的重要病害。菌核病因缺乏野生抗性資源、自然寄主廣泛、病原菌自身抗藥性等原因，在防治上一直存

2、在極大的困難。本論文以分離自佳木斯發(fā)病茄子植株上的核盤菌弱毒菌株Ep-1PN為材料，對核盤菌Ep-1PN中致病力衰退相關(guān)RNA病毒（SsDRV）進(jìn)行了以下一些研究，嘗試將其應(yīng)用于菌核病的生物防治： 采用RT-PCR及RACE克隆技術(shù)對從核盤菌弱毒菌株Ep-1PN中提取的5.4kbdsRNA片段進(jìn)行了全長cDNA測序，得到了全部5470個(gè)核苷酸序列，并已在GenBank登錄注冊（登錄號(hào)為AY147260）。 序列分析表明，

3、SsDRV只有一個(gè)開放式閱讀框（nt 93-5195），推定的氨基酸序列包含許多正鏈RNA病毒復(fù)制酶系中典型的甲基轉(zhuǎn)移酶、解螺旋酶和依賴RNA的RNA聚合酶（RdRp）保守區(qū)域；序列同源性比較發(fā)現(xiàn)SsDRV與植物上的Flexiviridae科allexivirus屬病毒以及一種未分類的侵染植物病原茵灰葡萄孢（Botrytis cinerea）的真菌病毒Botrytis virus F（BVF）有較高的同源性，但SsDRV因其缺乏外殼蛋白

4、和運(yùn)動(dòng)蛋白而有別于allexivirus屬植物病毒和BVF。 在SsDRV序列中部確定一個(gè)單一酶切位點(diǎn)ClaI（nt 2338），從位點(diǎn)的上游和下游分別設(shè)計(jì)引物與對應(yīng)的SsDRV末端序列以SsDRV核酸反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，PCR擴(kuò)增3’端和5’端包含ClaI酶切位點(diǎn)的片段，分別連接到pMD18-T載體上獲得亞克隆。選用T載體上的酶切位點(diǎn)SacI與SsDRV序列上的酶切位點(diǎn)ClaI雙酶切兩端序列的亞克隆，回收帶有SsDRV序列的cD

5、NA的片斷，連接后得到T載體上的SsDRV全長cDNA克隆。 在獲得的SsDRV全長cDNA前轉(zhuǎn)載來自構(gòu)巢曲霉的trpC啟動(dòng)子后，連同trpC酶切后連接到用于轉(zhuǎn)化植物的pCAMBIA1301載體上，同時(shí)用另一個(gè)trpC啟動(dòng)子替換pCAMBIA1301中原有的用于啟動(dòng)潮霉素抗性基因的CaMV 35S啟動(dòng)子，獲得用于轉(zhuǎn)化絲狀真菌的SsDRV全長侵染性cDNA轉(zhuǎn)化載體。 將構(gòu)建好的載體通過熱擊轉(zhuǎn)化導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105菌株，通